【正文】 我國科學家克隆了一系列農藥解毒或降解酶基因如黃桿菌的有機磷水解酶基因 opd、鄰單胞菌大質粒 pL1上的氯代鄰苯二酚 1， 2雙加氧酶基因、鄰單胞菌 M6的甲基對硫磷水解 酶基因 mpd以及昆蟲高抗性酯酶基因等，成功構建了一系列擁有自主知識產權的農藥高效降解工程菌，如通過導入甲基對硫磷水解酶基因 mpd構建了完全礦化甲基對硫磷的工程菌；將氯代鄰苯二酚 1， 2雙加氧酶基因導入甲胺磷降解菌株中，構建了降解甲胺磷和苯環(huán)類化合物的工程菌 TP2，將昆蟲高抗性酯酶基因（解毒酶基因）轉入大腸桿菌中，得到高效表達；構建了能降解有機氯及有機磷和同時降解 3種以上有機磷農藥的降解菌；構建了能同時高效降解甲基對硫磷和呋喃丹農藥的工程菌，在實驗室條件下降解 359 性能顯著，酶活提高 6倍。 國內外通過基因工程已經表達了多種來源的木聚糖酶，除了在造紙工業(yè)中應用外，在 食品工業(yè)、飼料工業(yè)、制藥工業(yè) 、 生產燃料等眾多行業(yè)中有著十分誘人的應用 價值或應用 前景 。 許多重要的芳烴及其氯代衍生物降解基因位于分子量超過 40kb的降解質粒上，如兒茶酚降解質粒、 3氯代苯甲酸 (3CBA)、 2,4二氯苯氧乙酸 (2,4D)降解質粒等。 圖 1612 轉座子 TnMTβ1的結構 (A)以及 微生物 細胞表面 的融合蛋白 MTβ (B)（ Valls等， 2020） B 357 A TnMTβ1的遺傳組成： mtb基因 ；卡那霉素抗性基因 (Km)； xylS基因 (編碼啟動子 Pm轉錄激活蛋白 XylS)；啟動 子 Pm； miniTn5 的 I末端和 O末端； mtb基因的 pelB信號序列 (ss) ； B 微生物 細胞表面 的融合蛋白 MTβ（ OM， 細胞外膜）。利用微生物和植物對這些重金屬離子進行富集的方法引起了人們越來越多的關注。它還能改造傳統(tǒng)生產工藝，實現(xiàn)生物制漿、生物漂白和生物制革等生產過程的清潔化、生態(tài)化或無廢化，能大大降低環(huán)境友好生物材料和生物能源的生產成本，使其部分或完全取代化學材料和化石能源。由于氧氣在液體介質中溶解度低，加之絲狀鏈霉菌培養(yǎng)基濃度較高，常常使細胞處于氧氣耗盡狀態(tài)，導致細胞生長微弱，抗生素產量下降。將完整的質粒和攜帶 片段的亞克隆 (pIJ2315)轉入鏈霉菌 AM7161 時，能合成相應抗生素梅德霉素；當它轉入 紫紅鏈霉菌 (S. violaceoruber)Bll40 或 Tu22 時，能合成相應的 榴菌素(granaticin)和 二氫榴菌素 (dihydrogranatic in)。 三、重組 DNA技術生產醫(yī)用抗生素 自 20 世紀 20 年代發(fā)現(xiàn)青霉素至今，從不同的微生物中分離出的抗生素已超過 12020 種。大量獲取這些工具酶是基因工程應用的重要領域之一。科學家偶然發(fā)現(xiàn)轉化假單胞菌降解質粒 NAH7 DNA 片段后的大腸桿菌能合成靛藍，因大腸桿菌能合成色氨酸酶，將培養(yǎng)基中的色氨酸轉變成吲哚； NAH7 質粒編碼的萘雙加氧酶又能將吲哚氧化成對吲哚 2， 3二氫二醇 (cisindole2,3dihydrodiol)，后者 自動脫水、空氣氧化后形成靛藍 (圖 1610)。我國科學家應用染色體整合擴增技術，成功地建 構了大量表達 βCGT的基因工程菌 BS167，振蕩試驗表明酶活力最高達 8 900 U/mL，有很好的應用潛力。轉基因凝乳酶成分單一，純度高 (小牛胃萃取液僅含 70~90%凝乳酶 )，作用時間 容易把握，生產的奶酪在風味上也與用從小牛胃中萃取的凝乳酶生產的奶酪相同。早在 1995年就能用基因工程菌生產工業(yè)用酶 (包括食品與洗潔劑 )。 圖 168 乙酰 CoA 催化 L絲氨酸合成 L半胱氨酸 虛線表示反饋抑制 2. 合成 L抗壞血酸的重組菌 L抗壞血酸的合成從 D葡萄糖開始，包括一步微生物發(fā)酵和一系列的化學反應，最后由 2酮 L古龍?zhí)撬?(2KLG)在酸催化作用下轉變成 L抗壞血酸。同時還可以對編碼這些酶的基因進行突變，使它們不易受到終產物反饋抑制。 ② 采取類似的方法，強化表達氨基酸輸出系統(tǒng)的關鍵基因，或者降低某些基因產物的表達速率，最大限度地解除氨基酸及其生物合成中間產物對其生物合成途徑可能造成的反饋抑制?？刂频鞍酌富虻谋磉_程度可以優(yōu)化發(fā)酵乳制品的組成，提高其營養(yǎng)價值；在生產菌中導入某些天然香料的生物合成基因以及甜味蛋白或多肽基因，可以改善產品的風味和口感； ③ 縮短生產時期。相反，當引入了多拷貝的 nifA基因后，根瘤菌的固氮酶活性和結瘤能力都 有顯著的提高。解決“老區(qū)問題 ” 的方法主要有使接種菌產生能夠抑制土著菌的抗菌素以及導入競爭結瘤相關基因增加菌劑的結瘤能力等。⑤ VA菌根真菌，它是一類與植物根系共生的真菌，幫助植物吸收多種礦質營養(yǎng)成分，特別是磷素營養(yǎng)。這類制品都有一個共同的 特點，即含有一定量的特定功能的微生物，而且這些活體微生物起著重要作用 。 （ 1）生物囊殺蟲劑 將 Bt毒素蛋白基因轉入螢光假單胞菌中， 使其高效表達并形成伴胞晶體，發(fā)酵后通過物理和化學方法將菌體殺死但不破壞伴胞晶體而且菌體外形保持完整，從而形成一種生物囊制劑（圖 166），這種制劑在田間應用時其有效期平均增加了兩百多倍， 對小菜蛾的殺蟲效果與化學農藥相當，無污染環(huán)境的副 作用，成為一種新型的微生物殺蟲劑，用于蔬菜害蟲防治。 我國通過缺失其生物合成途徑中的 C50甲基轉移酶而阻斷支路代謝，獲得了僅產 B 組分的工程菌，這種微生物農藥更加高效和低毒，還大通過輔助質粒導入 tnpI 基因 346 大簡化工藝流程和降低生產成本。但是，為了最大限度地保證基因工程菌環(huán)境釋放的安全性，要求將載體中的非 Bt來源的 DNA片段去掉，如抗生素抗性基因以及來自大腸桿菌的 DNA片段。我國通過這種方法構建的高毒力 Bt 菌株已通過農業(yè)基因工程安全審批完成了商品化生產試驗。 Bt在其生長過程中產生不同類型的殺蟲晶體蛋白（ ICPs）， 主要作用于鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、膜翅目等昆 蟲幼蟲以及原生動物門、螨類、扁形動物門等類群。 一、農業(yè)領域的基因工程細菌 (一 ) 微生物基因工程農藥 目前微生物農藥主要有微生物殺蟲劑、微生物殺菌劑、微生物除草劑及利用微生物代謝分泌的有效活性物質制成的農用抗生素殺蟲、殺菌劑 等 。 第三節(jié) 細菌基因工程的應用 基因工程的實踐主要有三種表現(xiàn)形式，其一是改造細菌使之性狀得到遺傳改良，獲得更好的應用效果，如殺蟲、固氮等，在這種情況下，基因工程的產品仍然是細菌本身。 位于細胞表面的 342 蛋白都可用于細胞表面展示，常見的載體蛋白包括大腸桿菌的外膜蛋白 (如 OmpA和 OmpC)和與肽聚糖相關的 脂蛋白 (Peptidoglycanassociated lipoprotein， PAL)，假單胞菌 (Pseudomonas spp)的外膜蛋白F(OprF)和 冰核蛋白 INP(Ice Nucleation Protein)， 蠟狀芽孢桿菌群 (Bacillus cereus group)的 S層表面蛋白 (Surface layer protein, Slayer protein)， 葡萄球菌 的表面 蛋白 A(SpA)， 胞外附屬結構 (如鞭毛 )的蛋白等 。 （ 2）整合載體 能 將目標基因整合到宿主的基因組 中 的載體稱為 整合載體 (integration vector), 一般通過同源 重組或轉座因子的轉座特性實現(xiàn)外源基因的整合。它 最顯著的特點是在極端生長條件或生命后期在細胞內形成中生芽孢 ， 芽孢具有極強的抗逆境能力。 革蘭氏陰性細菌通用的表達載體 革蘭氏陰性細菌通用的表達載體如 pAV10 等都是在低拷貝數(shù)、廣宿主質粒 pRK290 的 多克隆位點中插入來源于轉座子 Tn5 末端反向重復序列的一段 70bp DNA 而構建的 (圖 161)。通過超聲波破碎、離心 等 能 較 容易地對之進行初級純化。 利用tag的特性通?？梢詫θ诤系鞍走M行親和層析等分離提純， 因此 選擇融合表達 既 可以保護外源蛋白不受宿主內蛋白酶的降解，同時也大大 簡化 了 重組蛋白的純化 過程 。詳細內容見后文?？寺≥d體可以是質粒載體，也可以是將外源基因整合到染色體上的整合載體。本節(jié)主要介紹細菌基因工程中 構建表達載體的一般原則及其它 常見的一些表達系統(tǒng)。 第二節(jié) 細菌基因工程的表達系統(tǒng) 一、細菌基因工程的表達系統(tǒng) 細菌基因工程的表達系統(tǒng)由三部分組成：外源基因、表達載體和宿主 細菌。 目前，中國是世界上農業(yè)重組微生物環(huán)境釋放面積最大、種類最多和研究范圍最廣的國家，在我國境內申報并通過農業(yè)生物基因工程安全委員會批準的農業(yè)重組微生物在 40例以上，目前還有十余株轉基因細菌處于安全性評價和田間試驗階段?，F(xiàn)代生物科學技術的發(fā)展給農業(yè)微生物研究注入了新的活力，特別是近年來基因工程的研究為微生物遺傳改良提供了有效手段，使農業(yè)微生物發(fā)展成為生命科學領域中最為活躍、最具創(chuàng)新性的前沿之一。除食品用酶制劑外， 細菌基因工程菌也已成功應用于生產其他不同目的的酶，如用于將葡萄糖轉化為高果糖糖漿的葡萄糖異構酶； 應用于 PCR的耐熱 DNA聚合酶； 用于生產青霉素母核的青霉素酰化酶，用在洗衣粉中的堿性蛋白酶以及飼料用酶。分解其它有機物甚至 致癌物、有機汞以及有 效固定環(huán)境中重金屬離子的工程菌也展現(xiàn)在世人面前。 細菌 基因工程藥物 已 成為制藥行業(yè)的一支奇兵， 基因 工程 制 藥 已 成為 21世紀 制 藥業(yè)的支柱。幾年后，第一個基因工程產品 ──利用構建的基因工程菌生產人胰島素獲得成功，從此人類進入了生物技術的產業(yè)時代。 細菌不僅在現(xiàn)代生物技術的核心 —基因重組技術的誕生和技術進步中起到舉足輕重的作用，而且細菌的遺傳改造也是基因工程中歷史最早、研究最廣泛、取得實際應用成果最多的領域。 未來市場前景廣闊的藥 品 將集中 在 單克隆抗體、反義藥物、基因治療藥物、可溶性蛋白質類藥物和疫苗 等五 個類別中 ， 其中單克隆抗體的市場需求最令人注目，當前處于臨床試驗的各類單克隆抗體約 100個， 約 占在研生物技術藥品 總 數(shù)的 25%，目前全球單克隆抗體市場銷售額已達到 40億美元。在工業(yè)和生活廢水治理、重金屬污染土壤的 生物修復 (bioremediation)、農藥殘留的微生物降解、生物制漿和生物漂白等清潔生產技術的建立、石油污染的消除以及友好可再生 材料的合成等諸多方面，環(huán)境微生物基因工程菌取得了很大的技術突破，推動了傳統(tǒng)產業(yè)的技術工藝革新和產業(yè)結構調整，保護了環(huán)境，維持了地球生態(tài)環(huán)境的平衡。這些工業(yè)酶類的市場額（主要是食品、去污劑、紡織、皮革、造紙工業(yè)，而非醫(yī)藥業(yè)）在 2020年就已達到 2億美元。 在農業(yè)上，據不完全統(tǒng)計，世界各國獲 準進入田間釋放的重組微生物占已登記在案的遺傳工 程菌環(huán)境釋放總數(shù)的 %，其中受體微生物為細菌的占 %、病毒 %、真菌 ％。由我國學者研制的轉 ntrCnifA基因固氮斯氏假單胞菌 AC1541和蘇云金芽孢桿菌高產廣譜工程菌，均已通過農業(yè)部農業(yè)生物基因工程安全委員會審批進入安全性評價的商品化生產階段，標志著我國一批擁有自主知識產權的重組微生物農藥、肥料和飼料用酶產品已初具 產業(yè)規(guī)模。 外源基因的表達水平不僅與基因的來源、基因的性質以及載體有關，還取決于宿主細胞。 二、表達載體構建原則 表達載體實際上是在克隆載體的基礎上裝載了用于表達的一些 元件 (cassette)，當外源基因插入到合適的位點后，在宿主菌中就可啟動表達。 1. 啟動子的選擇 通過基因工程手段表達外源基因的目的大致有兩種，其一是超量表達，以達到最大限度地獲得 338 蛋白質產物。 2. 轉錄的有效性 為保證外源基因轉錄的有效性，在表達載體上應設法除去衰減序列 或插入抗轉錄終止序列以避免轉錄的提前終止，促使 mRNA有效地延伸和終止。 2． 構建可分泌蛋白 ，分泌到胞外培養(yǎng)基中 通常位于蛋白質 N 端稱為信號肽 (信號序列，引導肽 )的一段氨基酸序列會幫助蛋白通過細胞膜。用鹽酸胍或尿素變性溶解包涵體中的蛋白質，透析除去變性劑后，蛋白質可重新折疊復性。來源于 Tn5 的DNA 克隆片段包含兩個獨立而重疊的啟動子，每一個啟動子分別負責一個 Tn5 基因的轉錄。它們不僅是重要的工業(yè)菌種，也是基因表達研究的有價值材料，具有良好的分泌能力，遺傳背景清楚，生長迅速，培養(yǎng)條件簡便。 pDG1730是典型的枯草芽孢桿菌整合載體，可將外源基因整合到 ?淀粉酶基因內部。為了將目的蛋白展示于微生物細胞表面，還需要構建目的蛋白和外表面蛋白的融合。其二是制作生物反應 343 器，利用細菌來生產某種物質。微生物殺蟲劑中細菌類殺蟲劑以蘇云金芽孢桿菌推廣應用面積最大，而且殺蟲效果非常理想，此外，還有真菌殺蟲劑 、 病毒殺蟲劑等。 Bt殺蟲蛋白 對農業(yè)上許多重要作物害蟲具有專一毒殺性，而對 人、哺乳動物以及昆蟲的天敵非常安全。通過導入活力提高的殺蟲基因或雜合基因（ 如 cry1Ab 與 cry1C 基因的嵌合基因 ）也可提高殺蟲活性。 為 此 ，采用了 Bt轉座子中的位點特異性重組系統(tǒng)，在引入攜帶重組酶基因的輔助質粒的幫助下，質粒載體內部發(fā)生重組，形成兩個質粒，其中攜帶抗生素抗性基因和大腸桿菌基因片段的質粒由于不能復制而丟失 ，保留來自 Bt的 DNA片段 。 由于 目前有關鏈霉菌的基因簇克隆和遺傳操作技術平臺已經建立并日趨完善，隨著 現(xiàn)代