【正文】 我國(guó)科學(xué)家克隆了一系列農(nóng)藥解毒或降解酶基因如黃桿菌的有機(jī)磷水解酶基因 opd、鄰單胞菌大質(zhì)粒 pL1上的氯代鄰苯二酚 1， 2雙加氧酶基因、鄰單胞菌 M6的甲基對(duì)硫磷水解 酶基因 mpd以及昆蟲高抗性酯酶基因等，成功構(gòu)建了一系列擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的農(nóng)藥高效降解工程菌，如通過(guò)導(dǎo)入甲基對(duì)硫磷水解酶基因 mpd構(gòu)建了完全礦化甲基對(duì)硫磷的工程菌；將氯代鄰苯二酚 1， 2雙加氧酶基因?qū)爰装妨捉到饩曛?，?gòu)建了降解甲胺磷和苯環(huán)類化合物的工程菌 TP2，將昆蟲高抗性酯酶基因（解毒酶基因）轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，得到高效表達(dá)；構(gòu)建了能降解有機(jī)氯及有機(jī)磷和同時(shí)降解 3種以上有機(jī)磷農(nóng)藥的降解菌；構(gòu)建了能同時(shí)高效降解甲基對(duì)硫磷和呋喃丹農(nóng)藥的工程菌，在實(shí)驗(yàn)室條件下降解 359 性能顯著，酶活提高 6倍。 國(guó)內(nèi)外通過(guò)基因工程已經(jīng)表達(dá)了多種來(lái)源的木聚糖酶，除了在造紙工業(yè)中應(yīng)用外，在 食品工業(yè)、飼料工業(yè)、制藥工業(yè) 、 生產(chǎn)燃料等眾多行業(yè)中有著十分誘人的應(yīng)用 價(jià)值或應(yīng)用 前景 。 許多重要的芳烴及其氯代衍生物降解基因位于分子量超過(guò) 40kb的降解質(zhì)粒上，如兒茶酚降解質(zhì)粒、 3氯代苯甲酸 (3CBA)、 2,4二氯苯氧乙酸 (2,4D)降解質(zhì)粒等。 圖 1612 轉(zhuǎn)座子 TnMTβ1的結(jié)構(gòu) (A)以及 微生物 細(xì)胞表面 的融合蛋白 MTβ (B)（ Valls等， 2020） B 357 A TnMTβ1的遺傳組成： mtb基因 ；卡那霉素抗性基因 (Km)； xylS基因 (編碼啟動(dòng)子 Pm轉(zhuǎn)錄激活蛋白 XylS)；啟動(dòng) 子 Pm； miniTn5 的 I末端和 O末端； mtb基因的 pelB信號(hào)序列 (ss) ； B 微生物 細(xì)胞表面 的融合蛋白 MTβ（ OM， 細(xì)胞外膜）。利用微生物和植物對(duì)這些重金屬離子進(jìn)行富集的方法引起了人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注。它還能改造傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝，實(shí)現(xiàn)生物制漿、生物漂白和生物制革等生產(chǎn)過(guò)程的清潔化、生態(tài)化或無(wú)廢化，能大大降低環(huán)境友好生物材料和生物能源的生產(chǎn)成本，使其部分或完全取代化學(xué)材料和化石能源。由于氧氣在液體介質(zhì)中溶解度低，加之絲狀鏈霉菌培養(yǎng)基濃度較高，常常使細(xì)胞處于氧氣耗盡狀態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)微弱，抗生素產(chǎn)量下降。將完整的質(zhì)粒和攜帶 片段的亞克隆 (pIJ2315)轉(zhuǎn)入鏈霉菌 AM7161 時(shí)，能合成相應(yīng)抗生素梅德霉素；當(dāng)它轉(zhuǎn)入 紫紅鏈霉菌 (S. violaceoruber)Bll40 或 Tu22 時(shí)，能合成相應(yīng)的 榴菌素(granaticin)和 二氫榴菌素 (dihydrogranatic in)。 三、重組 DNA技術(shù)生產(chǎn)醫(yī)用抗生素 自 20 世紀(jì) 20 年代發(fā)現(xiàn)青霉素至今，從不同的微生物中分離出的抗生素已超過(guò) 12020 種。大量獲取這些工具酶是基因工程應(yīng)用的重要領(lǐng)域之一。科學(xué)家偶然發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化假單胞菌降解質(zhì)粒 NAH7 DNA 片段后的大腸桿菌能合成靛藍(lán)，因大腸桿菌能合成色氨酸酶，將培養(yǎng)基中的色氨酸轉(zhuǎn)變成吲哚； NAH7 質(zhì)粒編碼的萘雙加氧酶又能將吲哚氧化成對(duì)吲哚 2， 3二氫二醇 (cisindole2,3dihydrodiol)，后者 自動(dòng)脫水、空氣氧化后形成靛藍(lán) (圖 1610)。我國(guó)科學(xué)家應(yīng)用染色體整合擴(kuò)增技術(shù)，成功地建 構(gòu)了大量表達(dá) βCGT的基因工程菌 BS167，振蕩試驗(yàn)表明酶活力最高達(dá) 8 900 U/mL，有很好的應(yīng)用潛力。轉(zhuǎn)基因凝乳酶成分單一，純度高 (小牛胃萃取液僅含 70~90%凝乳酶 )，作用時(shí)間 容易把握，生產(chǎn)的奶酪在風(fēng)味上也與用從小牛胃中萃取的凝乳酶生產(chǎn)的奶酪相同。早在 1995年就能用基因工程菌生產(chǎn)工業(yè)用酶 (包括食品與洗潔劑 )。 圖 168 乙酰 CoA 催化 L絲氨酸合成 L半胱氨酸 虛線表示反饋抑制 2. 合成 L抗壞血酸的重組菌 L抗壞血酸的合成從 D葡萄糖開(kāi)始，包括一步微生物發(fā)酵和一系列的化學(xué)反應(yīng)，最后由 2酮 L古龍?zhí)撬?(2KLG)在酸催化作用下轉(zhuǎn)變成 L抗壞血酸。同時(shí)還可以對(duì)編碼這些酶的基因進(jìn)行突變，使它們不易受到終產(chǎn)物反饋抑制。 ② 采取類似的方法，強(qiáng)化表達(dá)氨基酸輸出系統(tǒng)的關(guān)鍵基因，或者降低某些基因產(chǎn)物的表達(dá)速率，最大限度地解除氨基酸及其生物合成中間產(chǎn)物對(duì)其生物合成途徑可能造成的反饋抑制?？刂频鞍酌富虻谋磉_(dá)程度可以優(yōu)化發(fā)酵乳制品的組成，提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值；在生產(chǎn)菌中導(dǎo)入某些天然香料的生物合成基因以及甜味蛋白或多肽基因，可以改善產(chǎn)品的風(fēng)味和口感； ③ 縮短生產(chǎn)時(shí)期。相反，當(dāng)引入了多拷貝的 nifA基因后，根瘤菌的固氮酶活性和結(jié)瘤能力都 有顯著的提高。解決“老區(qū)問(wèn)題 ” 的方法主要有使接種菌產(chǎn)生能夠抑制土著菌的抗菌素以及導(dǎo)入競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤相關(guān)基因增加菌劑的結(jié)瘤能力等。⑤ VA菌根真菌，它是一類與植物根系共生的真菌，幫助植物吸收多種礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)成分，特別是磷素營(yíng)養(yǎng)。這類制品都有一個(gè)共同的 特點(diǎn)，即含有一定量的特定功能的微生物，而且這些活體微生物起著重要作用 。 （ 1）生物囊殺蟲劑 將 Bt毒素蛋白基因轉(zhuǎn)入螢光假單胞菌中， 使其高效表達(dá)并形成伴胞晶體，發(fā)酵后通過(guò)物理和化學(xué)方法將菌體殺死但不破壞伴胞晶體而且菌體外形保持完整，從而形成一種生物囊制劑（圖 166），這種制劑在田間應(yīng)用時(shí)其有效期平均增加了兩百多倍， 對(duì)小菜蛾的殺蟲效果與化學(xué)農(nóng)藥相當(dāng)，無(wú)污染環(huán)境的副 作用，成為一種新型的微生物殺蟲劑，用于蔬菜害蟲防治。 我國(guó)通過(guò)缺失其生物合成途徑中的 C50甲基轉(zhuǎn)移酶而阻斷支路代謝，獲得了僅產(chǎn) B 組分的工程菌，這種微生物農(nóng)藥更加高效和低毒，還大通過(guò)輔助質(zhì)粒導(dǎo)入 tnpI 基因 346 大簡(jiǎn)化工藝流程和降低生產(chǎn)成本。但是，為了最大限度地保證基因工程菌環(huán)境釋放的安全性，要求將載體中的非 Bt來(lái)源的 DNA片段去掉，如抗生素抗性基因以及來(lái)自大腸桿菌的 DNA片段。我國(guó)通過(guò)這種方法構(gòu)建的高毒力 Bt 菌株已通過(guò)農(nóng)業(yè)基因工程安全審批完成了商品化生產(chǎn)試驗(yàn)。 Bt在其生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生不同類型的殺蟲晶體蛋白（ ICPs）， 主要作用于鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、膜翅目等昆 蟲幼蟲以及原生動(dòng)物門、螨類、扁形動(dòng)物門等類群。 一、農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的基因工程細(xì)菌 (一 ) 微生物基因工程農(nóng)藥 目前微生物農(nóng)藥主要有微生物殺蟲劑、微生物殺菌劑、微生物除草劑及利用微生物代謝分泌的有效活性物質(zhì)制成的農(nóng)用抗生素殺蟲、殺菌劑 等 。 第三節(jié) 細(xì)菌基因工程的應(yīng)用 基因工程的實(shí)踐主要有三種表現(xiàn)形式，其一是改造細(xì)菌使之性狀得到遺傳改良，獲得更好的應(yīng)用效果，如殺蟲、固氮等，在這種情況下，基因工程的產(chǎn)品仍然是細(xì)菌本身。 位于細(xì)胞表面的 342 蛋白都可用于細(xì)胞表面展示，常見(jiàn)的載體蛋白包括大腸桿菌的外膜蛋白 (如 OmpA和 OmpC)和與肽聚糖相關(guān)的 脂蛋白 (Peptidoglycanassociated lipoprotein， PAL)，假單胞菌 (Pseudomonas spp)的外膜蛋白F(OprF)和 冰核蛋白 INP(Ice Nucleation Protein)， 蠟狀芽孢桿菌群 (Bacillus cereus group)的 S層表面蛋白 (Surface layer protein, Slayer protein)， 葡萄球菌 的表面 蛋白 A(SpA)， 胞外附屬結(jié)構(gòu) (如鞭毛 )的蛋白等 。 （ 2）整合載體 能 將目標(biāo)基因整合到宿主的基因組 中 的載體稱為 整合載體 (integration vector), 一般通過(guò)同源 重組或轉(zhuǎn)座因子的轉(zhuǎn)座特性實(shí)現(xiàn)外源基因的整合。它 最顯著的特點(diǎn)是在極端生長(zhǎng)條件或生命后期在細(xì)胞內(nèi)形成中生芽孢 ， 芽孢具有極強(qiáng)的抗逆境能力。 革蘭氏陰性細(xì)菌通用的表達(dá)載體 革蘭氏陰性細(xì)菌通用的表達(dá)載體如 pAV10 等都是在低拷貝數(shù)、廣宿主質(zhì)粒 pRK290 的 多克隆位點(diǎn)中插入來(lái)源于轉(zhuǎn)座子 Tn5 末端反向重復(fù)序列的一段 70bp DNA 而構(gòu)建的 (圖 161)。通過(guò)超聲波破碎、離心 等 能 較 容易地對(duì)之進(jìn)行初級(jí)純化。 利用tag的特性通?？梢詫?duì)融合蛋白進(jìn)行親和層析等分離提純， 因此 選擇融合表達(dá) 既 可以保護(hù)外源蛋白不受宿主內(nèi)蛋白酶的降解，同時(shí)也大大 簡(jiǎn)化 了 重組蛋白的純化 過(guò)程 。詳細(xì)內(nèi)容見(jiàn)后文?？寺≥d體可以是質(zhì)粒載體，也可以是將外源基因整合到染色體上的整合載體。本節(jié)主要介紹細(xì)菌基因工程中 構(gòu)建表達(dá)載體的一般原則及其它 常見(jiàn)的一些表達(dá)系統(tǒng)。 第二節(jié) 細(xì)菌基因工程的表達(dá)系統(tǒng) 一、細(xì)菌基因工程的表達(dá)系統(tǒng) 細(xì)菌基因工程的表達(dá)系統(tǒng)由三部分組成：外源基因、表達(dá)載體和宿主 細(xì)菌。 目前，中國(guó)是世界上農(nóng)業(yè)重組微生物環(huán)境釋放面積最大、種類最多和研究范圍最廣的國(guó)家，在我國(guó)境內(nèi)申報(bào)并通過(guò)農(nóng)業(yè)生物基因工程安全委員會(huì)批準(zhǔn)的農(nóng)業(yè)重組微生物在 40例以上，目前還有十余株轉(zhuǎn)基因細(xì)菌處于安全性評(píng)價(jià)和田間試驗(yàn)階段?，F(xiàn)代生物科學(xué)技術(shù)的發(fā)展給農(nóng)業(yè)微生物研究注入了新的活力，特別是近年來(lái)基因工程的研究為微生物遺傳改良提供了有效手段，使農(nóng)業(yè)微生物發(fā)展成為生命科學(xué)領(lǐng)域中最為活躍、最具創(chuàng)新性的前沿之一。除食品用酶制劑外， 細(xì)菌基因工程菌也已成功應(yīng)用于生產(chǎn)其他不同目的的酶，如用于將葡萄糖轉(zhuǎn)化為高果糖糖漿的葡萄糖異構(gòu)酶； 應(yīng)用于 PCR的耐熱 DNA聚合酶； 用于生產(chǎn)青霉素母核的青霉素?；福迷谙匆路壑械膲A性蛋白酶以及飼料用酶。分解其它有機(jī)物甚至 致癌物、有機(jī)汞以及有 效固定環(huán)境中重金屬離子的工程菌也展現(xiàn)在世人面前。 細(xì)菌 基因工程藥物 已 成為制藥行業(yè)的一支奇兵， 基因 工程 制 藥 已 成為 21世紀(jì) 制 藥業(yè)的支柱。幾年后，第一個(gè)基因工程產(chǎn)品 ──利用構(gòu)建的基因工程菌生產(chǎn)人胰島素獲得成功，從此人類進(jìn)入了生物技術(shù)的產(chǎn)業(yè)時(shí)代。 細(xì)菌不僅在現(xiàn)代生物技術(shù)的核心 —基因重組技術(shù)的誕生和技術(shù)進(jìn)步中起到舉足輕重的作用，而且細(xì)菌的遺傳改造也是基因工程中歷史最早、研究最廣泛、取得實(shí)際應(yīng)用成果最多的領(lǐng)域。 未來(lái)市場(chǎng)前景廣闊的藥 品 將集中 在 單克隆抗體、反義藥物、基因治療藥物、可溶性蛋白質(zhì)類藥物和疫苗 等五 個(gè)類別中 ， 其中單克隆抗體的市場(chǎng)需求最令人注目，當(dāng)前處于臨床試驗(yàn)的各類單克隆抗體約 100個(gè)， 約 占在研生物技術(shù)藥品 總 數(shù)的 25%，目前全球單克隆抗體市場(chǎng)銷售額已達(dá)到 40億美元。在工業(yè)和生活廢水治理、重金屬污染土壤的 生物修復(fù) (bioremediation)、農(nóng)藥殘留的微生物降解、生物制漿和生物漂白等清潔生產(chǎn)技術(shù)的建立、石油污染的消除以及友好可再生 材料的合成等諸多方面，環(huán)境微生物基因工程菌取得了很大的技術(shù)突破，推動(dòng)了傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)的技術(shù)工藝革新和產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，保護(hù)了環(huán)境，維持了地球生態(tài)環(huán)境的平衡。這些工業(yè)酶類的市場(chǎng)額（主要是食品、去污劑、紡織、皮革、造紙工業(yè)，而非醫(yī)藥業(yè)）在 2020年就已達(dá)到 2億美元。 在農(nóng)業(yè)上，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，世界各國(guó)獲 準(zhǔn)進(jìn)入田間釋放的重組微生物占已登記在案的遺傳工 程菌環(huán)境釋放總數(shù)的 %，其中受體微生物為細(xì)菌的占 %、病毒 %、真菌 ％。由我國(guó)學(xué)者研制的轉(zhuǎn) ntrCnifA基因固氮斯氏假單胞菌 AC1541和蘇云金芽孢桿菌高產(chǎn)廣譜工程菌，均已通過(guò)農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)生物基因工程安全委員會(huì)審批進(jìn)入安全性評(píng)價(jià)的商品化生產(chǎn)階段，標(biāo)志著我國(guó)一批擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的重組微生物農(nóng)藥、肥料和飼料用酶產(chǎn)品已初具 產(chǎn)業(yè)規(guī)模。 外源基因的表達(dá)水平不僅與基因的來(lái)源、基因的性質(zhì)以及載體有關(guān)，還取決于宿主細(xì)胞。 二、表達(dá)載體構(gòu)建原則 表達(dá)載體實(shí)際上是在克隆載體的基礎(chǔ)上裝載了用于表達(dá)的一些 元件 (cassette)，當(dāng)外源基因插入到合適的位點(diǎn)后，在宿主菌中就可啟動(dòng)表達(dá)。 1. 啟動(dòng)子的選擇 通過(guò)基因工程手段表達(dá)外源基因的目的大致有兩種，其一是超量表達(dá)，以達(dá)到最大限度地獲得 338 蛋白質(zhì)產(chǎn)物。 2. 轉(zhuǎn)錄的有效性 為保證外源基因轉(zhuǎn)錄的有效性，在表達(dá)載體上應(yīng)設(shè)法除去衰減序列 或插入抗轉(zhuǎn)錄終止序列以避免轉(zhuǎn)錄的提前終止，促使 mRNA有效地延伸和終止。 2． 構(gòu)建可分泌蛋白 ，分泌到胞外培養(yǎng)基中 通常位于蛋白質(zhì) N 端稱為信號(hào)肽 (信號(hào)序列，引導(dǎo)肽 )的一段氨基酸序列會(huì)幫助蛋白通過(guò)細(xì)胞膜。用鹽酸胍或尿素變性溶解包涵體中的蛋白質(zhì)，透析除去變性劑后，蛋白質(zhì)可重新折疊復(fù)性。來(lái)源于 Tn5 的DNA 克隆片段包含兩個(gè)獨(dú)立而重疊的啟動(dòng)子，每一個(gè)啟動(dòng)子分別負(fù)責(zé)一個(gè) Tn5 基因的轉(zhuǎn)錄。它們不僅是重要的工業(yè)菌種，也是基因表達(dá)研究的有價(jià)值材料，具有良好的分泌能力，遺傳背景清楚，生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)便。 pDG1730是典型的枯草芽孢桿菌整合載體，可將外源基因整合到 ?淀粉酶基因內(nèi)部。為了將目的蛋白展示于微生物細(xì)胞表面，還需要構(gòu)建目的蛋白和外表面蛋白的融合。其二是制作生物反應(yīng) 343 器，利用細(xì)菌來(lái)生產(chǎn)某種物質(zhì)。微生物殺蟲劑中細(xì)菌類殺蟲劑以蘇云金芽孢桿菌推廣應(yīng)用面積最大，而且殺蟲效果非常理想，此外，還有真菌殺蟲劑 、 病毒殺蟲劑等。 Bt殺蟲蛋白 對(duì)農(nóng)業(yè)上許多重要作物害蟲具有專一毒殺性，而對(duì) 人、哺乳動(dòng)物以及昆蟲的天敵非常安全。通過(guò)導(dǎo)入活力提高的殺蟲基因或雜合基因（ 如 cry1Ab 與 cry1C 基因的嵌合基因 ）也可提高殺蟲活性。 為 此 ，采用了 Bt轉(zhuǎn)座子中的位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，在引入攜帶重組酶基因的輔助質(zhì)粒的幫助下，質(zhì)粒載體內(nèi)部發(fā)生重組，形成兩個(gè)質(zhì)粒，其中攜帶抗生素抗性基因和大腸桿菌基因片段的質(zhì)粒由于不能復(fù)制而丟失 ，保留來(lái)自 Bt的 DNA片段 。 由于 目前有關(guān)鏈霉菌的基因簇克隆和遺傳操作技術(shù)平臺(tái)已經(jīng)建立并日趨完善，隨著 現(xiàn)代