【正文】 整晶后繼續(xù)濃縮，若再次出現(xiàn)新晶核就要多次進(jìn)行整晶。 (二 )谷氨酸一鈉的結(jié)晶析出 結(jié)晶操作的基本過(guò)程可分為濃縮、起晶、整晶、育晶、放罐等幾個(gè)階段。溫度控制在 4050℃ 條件下進(jìn)行脫色較合適?；钚蕴糠譃榉勰畹乃幱锰亢?GH15顆?；钚蕴?jī)煞N。用此法除鐵 (或鋅 )，不但解決了硫化鈉除鐵引起的環(huán)境污染問(wèn)題，改善了操作條件，而且提高了味精質(zhì)量，是一種較為理想的除鐵方法。中和反應(yīng)控制 pH為 ～ 。 中和劑：在味精生產(chǎn)中，中和谷氨酸可用氫氧化鈉，也可用純堿 (Na2C03)，一般不用液堿（液堿含雜質(zhì)氯化鈉較多，影響結(jié)晶味精成品的質(zhì)量。此后加酸速度要慢，直到 pH為 ，停止加酸，繼續(xù)攪拌 20h結(jié)束。 ＞ 30℃ ， β 型結(jié)晶增加。周期長(zhǎng)，占地面積大。 (6)發(fā)現(xiàn)染菌的罐，下次空罐消毒加入甲醛后，再用蒸汽熏蒸 ~／ m3。車間、環(huán)境衛(wèi)生差，易引起染菌。若罐體或管件有極其微小的 漏孔時(shí)，易引起染菌。 平板檢查時(shí)，先將滅菌后的培養(yǎng)基倒人培養(yǎng)皿內(nèi)，冷卻，接種，于 37C下培養(yǎng) 24h，鏡檢。 (4)放罐重消毒。進(jìn)行藥物防治可添加金屬螯合劑 (抑制噬菌體的吸附或 DNA的注入 )、表面活性劑 (作用于細(xì)菌表面，抑制噬菌體的吸附 )、抗生素 (抑制噬菌體蛋白質(zhì)合成 )等。 （ 1） .嚴(yán)格控制活菌體的排放 搖瓶液、取樣液、廢棄菌液或發(fā)酵液均應(yīng)先滅菌，后排放。 ?發(fā)酵液 pH逐漸上升， 4～ 8h內(nèi)可達(dá) 8． 0以上，且不下降， ?不耗糖或耗糖緩慢。 ?嗜氧性。 （ 4）發(fā)酵后期： 菌體衰老，糖耗慢，殘?zhí)堑汀? （ 2）對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期： 糖耗快，尿素大量分解使 pH上升，氨被利用后 pH又迅速下降。當(dāng)菌體生長(zhǎng)緩慢、 pH偏高時(shí)，應(yīng)減少通風(fēng)量，或停止攪拌，以利于長(zhǎng)菌。 ? 控制 pH方法：流加尿素和氨水 ? 流加方式：根據(jù)菌體生長(zhǎng)、 pH變化、糖耗情況和發(fā)酵階段等因素決定 ? 控制： （ 1）菌體生長(zhǎng)或耗糖慢時(shí)，少量多次流加尿素，避免 pH過(guò)高 （ 2）菌體生長(zhǎng)或耗糖過(guò)快時(shí)，流加尿素可多些，以抑制菌體生長(zhǎng)。 成 分 菌種 B9 D110 糖 10 15 玉米漿 ～ ～ 磷酸氫二鈉 硫酸鎂 ～ Fe2＋ 、 Mn2＋ 初 尿 ～ 流加尿 1～ ～ ～ pH 表 4—1 不同生產(chǎn)菌谷氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基配方 （四） 谷氨酸發(fā)酵工藝控制 溫度對(duì)谷氨酸發(fā)酵的影響 微生物在一定條件下 ， 都有一個(gè)最適的生長(zhǎng)溫度范圍 。 ? 鉀鹽：鉀鹽多，有利于產(chǎn)酸；鉀鹽少，有利于菌體生長(zhǎng) ? 微量元素：主要是錳（許多酶的激活劑）、鐵（細(xì)胞色素、細(xì)胞色素氧化酶和過(guò)氧化氫酶活性基團(tuán)組分，可促進(jìn)谷氨酸產(chǎn)生菌的生長(zhǎng)）， 106－ 104mol/L。 目前，較多采用低糖濃度流加發(fā)酵控制。液化液經(jīng)二次噴射，維持溫度 130－140℃ ，滅酶 5－ 10min，再經(jīng)板式換熱器冷卻至 70℃ 以下，進(jìn)入糖化罐。 – 中和：燒堿中和，至 – 脫色：活性炭脫色和脫色樹脂。 – pH在 ， 殘?zhí)呛吭?。1000ml三角瓶裝量 200－ 250ml，震蕩， 32℃ ，培養(yǎng) 12h。 由于生物素充足 ， 繁殖的菌體細(xì)胞均為谷氨酸非積累型細(xì)胞 。折斷分裂呈八字排列或枷狀排列，不運(yùn)動(dòng) G＋ 好氧或厭氧 葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸，少數(shù)利用乳糖產(chǎn)酸 短桿菌屬 短的不分支直桿菌，多數(shù)不運(yùn)動(dòng)，少數(shù)運(yùn)動(dòng)有鞭毛。 ⑴ 選育呼吸鏈抑制劑抗性突變株 如可選育丙二酸 、氧化丙二酸 、 氰化鉀 、 氰化鈉抗性突變株來(lái)實(shí)現(xiàn) 。 ⑵選育強(qiáng)化 CO2固定反應(yīng)的突變株 這可通過(guò)選育以琥珀酸或蘋果酸為唯一碳源生長(zhǎng)良好的突變株、氟丙酮酸敏感突變株以及丙酮酸或天冬氨酸缺陷突變株來(lái)實(shí)現(xiàn)。 ⑸阻止谷氨酸進(jìn)一步代謝 （不代謝） 細(xì)胞還可以谷氨酸為前體繼續(xù)向下合成谷氨酰胺等，必然導(dǎo)致谷氨酸的積累量減少。但通過(guò) HMP也可生成核糖、核苷酸、莽草酸、芳香族氨基酸、輔酶 Q、維生素 K、葉酸等物質(zhì)。 NH4+的供給方式： （ 1）液氨 （ 2）流加尿素 D、磷酸鹽 過(guò)量：（ 1）促進(jìn) EMP途徑，打破 EMP與 TCA之 間的平衡，積累丙酮酸，產(chǎn)生乳酸等 …… （ 2）產(chǎn)生并積累 Val， Glucose 丙酮酸 丙酮酸 + 活性乙醛 α乙酰乳酸 Val Val（ 1）可以抑制葡萄糖 丙酮酸，使 GA的生物合成受到阻止 （ 2）消耗了丙酮酸，降低了糖酸轉(zhuǎn)化率 （ 3）發(fā)酵液中的 Val存在，嚴(yán)重的影響 GA 的結(jié)晶、提出 第五節(jié) 谷氨酸生物合成的調(diào)節(jié)機(jī)制 一、谷氨酸生物合成的調(diào)節(jié) ① 谷氨酸脫氫酶 ② ?酮戊二酸脫氫酶 ③磷酸烯醇丙酮酸羧化酶 ④檸檬酸合成酶 ⑴ 優(yōu)先合成 ? 在微生物的代謝中， Glu比 Asp優(yōu)先合成； 合成過(guò)量時(shí)則抑制谷氨酸脫氫酶，使代謝轉(zhuǎn)向合成 Asp； Asp過(guò)量時(shí)反饋抑制 PEP羧化酶的活力，停止合成草酰乙酸。 d、 VH對(duì)菌體細(xì)胞膜通透性的影響 通常谷氨酸發(fā)酵采用的菌種都是 VH，而 VH又是菌體細(xì)胞膜合成的必須物質(zhì)，因此，可以通過(guò)控制 VH的濃度（ 干擾磷脂中的脂肪酸的生物合成）來(lái)實(shí)現(xiàn)的來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)菌體細(xì)胞膜通透性的調(diào)節(jié) 。 而丙酮酸氧化脫羧的速度未改變 丙酮酸積累 A、生物素對(duì) GA發(fā)酵的影響 主要影響糖降解速度，不影響 EMP與 HMP途徑的比率。 ? 表面活性劑：對(duì)生物素有拮抗作用，拮抗不飽和脂肪酸的合成，導(dǎo)致磷脂合成不足，影響細(xì)胞膜的完整性，提供細(xì)胞膜對(duì)谷氨酸的滲透性。 ? 接合轉(zhuǎn)移可用于基因在親緣關(guān)系遠(yuǎn)的物種之間的轉(zhuǎn)移，并且可將外源基因整合于染色體上，易于穩(wěn)定遺傳。 基因工程菌 通過(guò)基因工程技術(shù)，構(gòu)建理想的工程菌株 受體系統(tǒng)及克隆表達(dá)的研究 受體的獲得 ? 目前使用的氨基酸工程菌受體主要是大腸桿菌 K12及棒狀桿菌家族，通常是通過(guò)誘變選育出的基礎(chǔ)產(chǎn)率較高的菌株。 4. 體內(nèi)及體外基因重組的方法 ? 基因工程包括細(xì)胞內(nèi)基因重組方法和試管內(nèi)的體外基因重組方法。 ? 如用高絲氨酸缺陷株的賴氨酸發(fā)酵，谷氨酸缺陷株的鳥氨酸發(fā)酵，異亮氨酸缺陷菌株的脯氨酸發(fā)酵。 第二節(jié)、氨基酸發(fā)酵菌株的育種 是氨基酸代謝控制發(fā)酵的基本策略之一 ? 發(fā)酵工程要求微生物大量地合成特定的代謝產(chǎn)物，這一目的只有當(dāng)微生物的部分代謝調(diào)控機(jī)制遭到破壞時(shí)才能達(dá)到。 表 38 世界氨基酸主要生產(chǎn)廠家生產(chǎn)能力 品名 廠家 生產(chǎn)能力 品名 廠家 生產(chǎn)能力 蛋氨酸 日本曹達(dá) 20220 谷氨酸 味之素 60000 蛋氨酸 日本住友化學(xué) 5000 谷氨酸 日本旭化成 15000 蛋氨酸 日本化藥 2500 谷氨酸 協(xié)和發(fā)酵 15000 蛋氨酸 德國(guó)迪高沙 85000 谷氨酸 日本武田藥品 15000 蛋氨酸 法國(guó) AEC 105000 色氨酸 味之素 100 蛋氨酸 美國(guó)孟山都 45000 色氨酸 昭和電工 200 蛋氨酸 墨西哥阿爾拜梅克斯 5000 色氨酸 三井東壓 100 蛋氨酸 西班牙 Sodeti 4000 色氨酸 田造制藥 50 蛋氨酸 蘇聯(lián) Volgograd 4000 色氨酸 日本化藥 50 色氨酸 協(xié)和發(fā)酵 50 賴氨酸 日本味之素 55000 甘氨酸 日本有機(jī)合成化學(xué) 6000 賴氨酸 日本協(xié)和發(fā)酵 20500 甘氨酸 協(xié)和發(fā)酵 5000 賴氨酸 日本東麗 6500 甘氨酸 日本化藥 1000 賴氨酸 南朝鮮味元 10000 丙氨酸 武藏野化學(xué)研究所 —— 丙氨酸 日本化藥 —— 氨基酸的生產(chǎn)方法 ? 發(fā)酵法： 直接發(fā)酵法：野生菌株發(fā)酵、營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變發(fā)酵、抗氨基酸結(jié)構(gòu)類似物突變株發(fā)酵、抗氨基酸結(jié)構(gòu)類似物突變株的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株發(fā)酵和營(yíng)養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變株發(fā)酵。 –α 碳原子分別以共價(jià)鍵連接氫原子、羧基和氨基及側(cè)鏈。第三章 氨基酸發(fā)酵工藝學(xué) 學(xué)習(xí)氨基酸發(fā)酵工藝學(xué)的目的、研究對(duì)象、任務(wù)及內(nèi)容 氨基酸發(fā)酵是典型的代謝控制發(fā)酵 ， 由發(fā)酵所生成的產(chǎn)物 ——氨基酸 ，都是微生物的中間代謝產(chǎn)物 ， 它的積累是建立在對(duì)微生物正常代謝的抑制 。側(cè)鏈不同，氨基酸的性質(zhì)不同。包括 添加前體發(fā)酵法 ：如用鄰氨基苯甲酸，生產(chǎn) L色氨酸；甘氨酸生產(chǎn) L絲氨酸。用人工誘變的方法有目的地改變微生物固有的調(diào)節(jié)機(jī)制，使合成產(chǎn)物的途徑暢通無(wú)阻，最大限度地積累特定產(chǎn)物，這種發(fā)酵稱為代謝控制發(fā)酵。 谷氨酸棒狀桿菌的蘇氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸和賴氨酸的合成是與分枝途徑相聯(lián)系的 (圖 48)，篩選高絲氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型后，限量供給蘇氨酸時(shí)，就能解除由蘇氨酸和賴氨酸的協(xié)同反饋抑制作用，而獲得賴氨酸的過(guò)量生產(chǎn)。 ? 體內(nèi)基因重組在應(yīng)用上又稱為雜交育種，主要方法包括：轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、接合轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞融合等，這都是在細(xì)胞內(nèi)暫時(shí)地產(chǎn)生染色體的局部二倍體，在兩條 DNA鏈之間引起兩次以上的交叉，是遺傳性重組現(xiàn)象。 ? 大腸桿菌遺傳背景研究得清楚，載體系統(tǒng)完善，利于工程菌的構(gòu)建，但它含有內(nèi)毒素且不能將蛋白產(chǎn)物分泌至胞外，為應(yīng)用帶來(lái)困難。 第三節(jié) 氨基酸發(fā)酵的代謝控制 ? 控制發(fā)酵的條件 ? 控制細(xì)胞滲透性 ? 控制旁路代謝 ? 降低反饋?zhàn)饔梦锏臐舛? ? 消除終產(chǎn)物的反饋抑制與阻遏作用 ? 促進(jìn) ATP的積累，以利氨基酸的生物合成 一、菌種的代謝調(diào)控 是氨基酸代謝控制發(fā)酵的基本策略之二 控制發(fā)酵環(huán)境條件 – 專性需氧菌，控制環(huán)境條件可改變代謝途徑和產(chǎn)物。 ? 青霉素：抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的后期合成，形成不完整的細(xì)胞壁，使細(xì)胞膜失去保護(hù)，使胞內(nèi)外的滲透壓差導(dǎo)致細(xì)胞膜的物理?yè)p傷，增大谷氨酸向胞外漏出的滲透性、 生物素 阻斷脂肪酸的合成 影響細(xì)胞膜的合成 表面活性劑 對(duì)生物素有拮抗 阻斷脂肪酸的合成 影響細(xì)胞膜的合成 在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期添加青霉素 抑制細(xì)胞壁合成 細(xì)胞膜損傷 甘油缺陷型 磷脂的合成受阻 影響細(xì)胞膜的合成 油酸缺陷型 阻斷不飽和脂肪酸的合成 影響細(xì)胞膜的合成 提高細(xì)胞膜的 谷氨酸通透性 控制磷脂的合成 使細(xì)胞膜受損（如表面活性劑） 青霉素?fù)p傷細(xì)胞壁，間接影響細(xì)胞膜 控制磷脂含量 通過(guò)油酸的合成 通過(guò)甘油合成 直接控制磷脂合成 控制旁路代謝 降低反饋?zhàn)饔梦锏臐舛? ? 利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株進(jìn)行氨基酸發(fā)酵必須限制所要求的氨基酸的量。生物素充足的條件下，丙酮酸以后的氧化活性雖然也得到提高，但由于糖降解速度顯著提高，打破了糖降解速度與丙酮酸氧化速度之間的平衡，丙酮酸趨于生成乳酸的反應(yīng)，引起乳酸的溢出。 葡萄糖 丙酮酸 + 丙酮酸 乙酰輔酶 A 乙酰輔酶Ａ 乙酰輔酶 A羧化酶 （ 輔酶是 VH ） CO2 丙二酰輔酶 A 丙二酰輔酶 A C4 C6 CO2 培養(yǎng)基中生物素限量時(shí)，胞內(nèi) AA 92% 胞外 培養(yǎng)基中生物素豐富時(shí)，胞內(nèi) AA 12% 胞外 CO2 ? Glu生產(chǎn)菌大多是生物素缺陷型，發(fā)酵時(shí)控制生物素亞適 量，使細(xì)胞變形拉長(zhǎng)，改變了細(xì)胞膜的通透性引起代謝失 調(diào)使 Glu得以積累。 ⑵ 谷氨酸脫氫酶 (GDH)的調(diào)節(jié) 谷 aa脫氫酶 谷 aa對(duì)其反饋抑制和反饋?zhàn)瓒? ⑶ 檸檬酸合成酶的調(diào)節(jié) 檸檬酸合成酶 TCA的關(guān)鍵酶，受能荷調(diào)節(jié)，谷 aa反饋?zhàn)瓒簦瑸躅^酸反饋抑制 所以，正常代謝不積累 Glu ⑷ 異檸檬酸脫氫酶的調(diào)節(jié) 細(xì)胞內(nèi) α酮戊二酸的量與異檸檬酸的量需維持平衡 。消耗了葡萄糖，使谷氨酸的產(chǎn)率降低。要避免谷氨酸被菌體利用，還需要切斷谷氨酸向下的代謝途徑。 ⑴選育抗 Vp類衍生物突變株 ?選育抗 Vp類衍生物，如香豆素、盧丁等突變株，都能遺傳性的改變細(xì)胞膜的滲透性。 ⑵ 選育 ADP磷酸化抑制劑抗性突變株 如可選育2,4二硝基酚 、 羥胺 、 砷 、 胍等抗性突變株來(lái)實(shí)現(xiàn) 。 G＋ 好氧 葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸 小桿菌屬 桿狀，形態(tài)與排列與棒狀桿菌相似 G＋ 好氧 發(fā)酵糖產(chǎn)酸弱，主要產(chǎn)乳酸，不產(chǎn)氣 節(jié)桿菌屬 培養(yǎng)過(guò)程細(xì)胞形態(tài)易變化，先由球菌變桿菌，隨后由桿菌變球菌，不運(yùn)動(dòng) G＋ 變 G－ ，后由 G－ 變G＋ 好氧 發(fā)酵糖產(chǎn)酸極少或不產(chǎn)酸。