第二十五章基因結構分析的基本策略-免費閱讀
【正文】 由于啟動子中的順式作用元件在基因的特異性表達中發(fā)揮重要作用 ， 因此 ， 可以通過連接報告基因研究啟動子的功能 。 ?當選擇 GenBank Report格式后 ， 屏幕顯示較完整的基因記錄 ， 包括：基因位點 (Locus） 、 基因定義 (Definition） 、 基因存取號(Accession） 、 核酸編號 (NID ） 、 關鍵詞 (Keywords） 、 來源(Source） 、 組織分類 (Organism)、 參考文獻 (Reference)、 著者(Author） 、 題目 (Title） 、 期刊 (Journal） 、 Medline存取號(Medline） 、 序列特征 (Features） 、 基因 (Gene） 、 CDS（ cDNA） 、等位基因 (Allele） 對等的肽 (MatPeptide ） 、 計算堿基數 (Base Count） 、 原序列 (Origin） 。 ?乙基化干擾實驗 (Ethylation interference assay) 是利用化學試劑對活細胞 DNA進行乙基化修飾，從而干擾蛋白質與 DNA的結合。 ?基因結構特點成為基因組范圍內高通量掃描基因的重要靶標 ， 基因的轉錄起始點 、 啟動子以及編碼序列是基因的重要結構特征 。 目 錄 第二節(jié) 基因轉錄起始點的鑒定 目 錄 主要內容： 一、基因轉錄起始點的序列特征 二、基因轉錄起始點的序列分析 目 錄 一、基因轉錄起始點的序列特征 TATA box CAAT box GC box 增強子 順式作用元件 結構基因 GCGCCAATTATA 轉錄起始點 1. 真核基因及其調控元件 目 錄 II 型啟動子的 TSS： ?沒有明確的保守序列 ?有一種趨勢 ， 即 mRNA 的第一個堿基是 A，其側翼堿基傾向于是嘧啶 ?與 mRNA第一個堿基對應的位置標記為 1區(qū) ?3 ~ +5區(qū)域被稱作起始子 (initiator) 2. 轉錄起始點（ TSS） +10 +20 Start site 10 20 30 40 +1 ATG 3 +5 Initiator Py2CAPy5 目 錄 二、基因轉錄起始點的序列分析 思考： ?轉錄起始點 (TSS)位于基因編碼序列的 5?端 ?基因編碼區(qū)是指能體現(xiàn)在多肽鏈中的核苷酸序列 ?多肽鏈是以 mRNA為模板經翻譯合成的 因此， 分析鑒定 TSS的方法都是以 cDNA為切入點 目 錄 1. cDNA克隆測序 AAAAAn AAAAAn AAAAAn mRNA 反轉錄酶 AAAAAn Oligo (dT)1518 TTTTT1518 cDNA第一鏈 CCCCC TTTTT1518 cDNA第一鏈 nCCCC nGGGG cDNA第二鏈 克隆擴增， 5?端測序分析 反轉錄酶的末端轉移酶活性 Oligo (dG)1518 mRNA 與線性載體相連接 要求： cDNA的 5?端完整無缺 目 錄 2. cDNA末端快速擴增技術 (RACE) ?傳統(tǒng)的 RACE： AAAAAn mRNA AAAAAn TTTTT1518 cDNA mRNA 5? 3? 反轉錄酶 Oligo (dT)1518 末端轉移酶 dGTP TTTTT1518 nGGGGG 錨定 PCR擴增 TTTTT1518 nGGGGG nCCCCC 錨定引物 特異引物 PCR產物 目 錄 ?DeepRACE： 用寡核苷酸替代 mRNA的 5′端帽結構以及發(fā)光標記巢氏 PCR引物實現(xiàn)高通量鑒定轉錄起始點 AAAAAn 5?p 帽 mRNA 牛小腸磷酸酶 (CIP) AAAAAn 5?帽 煙草酸焦磷酸酶 (TAP) AAAAAn 5? 將 5?RACE adaptor (寡核苷酸 )加到脫帽 RNA分子上 AAAAAn 5?RACE adaptor (寡核苷酸 ) 反轉錄酶 10nt 隨機引物 目 錄 5?RACE adaptor 5?RACE adaptor 5?RACE adaptor 5?RACE adaptor 長短不同的 cDNA 隨機引物 用 10nt隨機引物與 5?RACE引物進行 PCR擴增 5?RACE adaptor 5?RACE adaptor 5?RACE adaptor 5?RACE adaptor PCR產物 隨機引物 以 5’RACE引物和 5’端甩尾的基因特異性反向引物進行巢氏 PCR 5?RACE adaptor 以 5’RACE發(fā)光標記引物對 PCR混合物直接進行一次性測序 分析基因轉錄起始點 目 錄 ?在 RACE的基礎上，通過在轉錄本 5 ′端引入一個特殊的 II型限制性核酸內切酶識別位點，實現(xiàn)了基因 5 ′端短片段串聯(lián)連接產物一次測序分析多個基因轉錄起始點的目的 ?主要有兩種方法： ?5 ′端連續(xù)分析基因表達 （ 5 ′ end serial analysis of gene expression, 5 ′ SAGE） ?帽分析基因表達 （ cap analysis gene expression, CAGE） 目 錄 (1) 5 ′ SAGE ?5′SAGE是在 PCR過程中將 MmeI酶切位點引物 cDNA的 5′端，通過酶切和連接獲得不同短片段重復序列，并對重復序列進行測序獲得大量片段序列信息 ?不同序列的短片段代表不同基因的轉錄起始點 (TSS) MmeI: ?是一種特殊的 II型限制性核酸內切酶 ?識別的序列不是回文結構，而是 不對稱的 DNA序列 5′
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