【正文】 尤其要強(qiáng)烈感謝我的論文指導(dǎo)老師 — 楊文佳老師，他對(duì)我無(wú)私地指導(dǎo)和幫助，不厭其煩幫助我進(jìn)行論文的修改和改進(jìn)。系統(tǒng)發(fā)育樹的分析中， SpHSP90 與 赤擬谷盜Tribolium castaneum 的 TcHSP90 親緣關(guān)系最近，最先聚為一支。而熱激蛋白是一大類應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫的重要的蛋白。與赤擬谷盜 Tribolium castaneum()， 斜紋夜蛾 Spodoptera litura（ ）以及家蠶 Bombyx mori（ ）均在同一支上，這 與 Blast 同源性分析的結(jié)果大致上吻合 (圖 )。 N端氨基酸為蛋氨酸（ Met， M）為穩(wěn)定型氨基酸，蛋白質(zhì)半衰期為 30 小時(shí)，不穩(wěn)定性指數(shù)未 ，為穩(wěn)定蛋白質(zhì)。 N端氨基酸為蛋氨酸（ Met， M）為穩(wěn)定型氨基酸，蛋白質(zhì)半衰期為 30 小時(shí)，不穩(wěn)定性指數(shù)未 ，為穩(wěn)定蛋白質(zhì)。 –T Easy載體（ Promega）連接，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，藍(lán)色斑篩選，并進(jìn)行驗(yàn)證；將陽(yáng)性的克隆菌液送到 Invitrogen 公司測(cè)序。C 孵育 10 min， 4176。 使用SmartSpecTM 3000 核酸濃度分析儀分析所提取 RNA 的濃度及純度。其中，熱激蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)是目前研究得最多的，也是被認(rèn)為與昆蟲耐熱性關(guān)系最密切的因素之一 [19]。成蟲白天喜鉆；蛀在日落 前后，遷出庫(kù)外在周圍環(huán)境介體 (如墻壁、門窗 )上活動(dòng)。 Dahlgaard等研究發(fā)現(xiàn)，高溫處理果蠅成蟲后，檢查不同時(shí)段 HSP70的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，果蠅的耐熱性與 HSP70的表達(dá)量呈正相關(guān)。通過對(duì)熱激蛋白基因缺失突變體的研究證明，至少某些熱激蛋白對(duì)有機(jī)體在高溫下的存活和耐熱性的獲得是必需的。在適宜的溫度范圍之內(nèi)，昆蟲的生命活動(dòng)處于積極狀態(tài)，體內(nèi)能耗較小，死亡率較低，生殖力較強(qiáng)；而當(dāng)環(huán)境溫度超過一定范圍時(shí)，昆蟲的生命活動(dòng)就會(huì)受到嚴(yán)重影響，甚至?xí)鸢l(fā)育異常乃至死亡。上游 ,存在如 nGAAn這樣的序列，稱為熱激調(diào)控元件（ Heat shock elements, HSE），又叫 熱應(yīng)答元件 ,它具有增強(qiáng)子的一些特性。還有的分為 HSPl00（分子量范圍在 100104kDa）、 HSP90、 HSP70、 HSP60和小分子 HSPs（ sHSPs,分子量范圍在 1230kDa）等 5個(gè)家族。由于熱激蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)迅速，分布廣泛，即便在非熱激細(xì)胞中也存在著由熱激蛋白同源基因編碼的類似的蛋白質(zhì)。 1982 年，在美國(guó)冷泉召開了第一屆研究熱激蛋白的國(guó)際會(huì)議，從此，世界上對(duì)于熱激蛋白的研 究便蓬勃發(fā)展起來，其分子伴侶的功能也逐漸被人發(fā)現(xiàn) [3]。通過 ProtParam 軟件在線分析， SpHSP90 基因推導(dǎo)的蛋白質(zhì)分子式為 C3650H5816N968O1161S27，理論分子量為 kDa，等電點(diǎn)為 ，氨基酸序列中含有HSP90 家族的 5 個(gè)保守基序，以及細(xì)胞質(zhì)型 HSP90 C端基序（ MEEVD），結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明SpHSP90 具有 HSP90 家族的典型結(jié)構(gòu)特征，系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析表明它與多種昆蟲的 HSP90序列有較高的同源性。 通過對(duì)藥材甲的 HSP 基因克隆及序列分析 得出相關(guān)的結(jié)論。畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）中凡引用他人已經(jīng)發(fā)表或未發(fā)表的成果、數(shù)據(jù)、觀點(diǎn)等，均已明確注明 出處。 熟悉掌握高壓滅菌器、移液器、電泳儀、 PCR、 凝膠成像儀、常溫離心機(jī)等儀器的使用方法。 SpHSP70 基因的開放閱讀框長(zhǎng)度為1950 bp，編碼 650 個(gè)氨基酸。 gene cloning 第一章 文獻(xiàn)綜述 1. 熱激蛋白（ Heat Shock Protein， HSP）概述 熱激蛋白（ Heat Shock Protein）亦稱熱休克蛋白或應(yīng)激蛋白（ Heat Stress Protein），是貴陽(yáng)學(xué)院畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 3 細(xì)胞或者生物體在一定時(shí)間內(nèi)（幾小時(shí)，幾分鐘，甚至幾秒鐘）遭受到高于其自身正常生長(zhǎng)溫度（一般稱為亞致死 溫度）的時(shí)候新合成的或含量增加的一種蛋白質(zhì) [1]，其特點(diǎn)是分布較廣，表達(dá)具有多樣性。但對(duì)于不同的生物種類，誘導(dǎo)熱激蛋白的合成溫度是不盡相同的，并且熱激后其回復(fù)時(shí)間也因種類不同而各有所異。也有的 將其分為 HSP60、 HSP70、 HSP90、小分子 HSP及泛素 4個(gè)家族，并認(rèn)為來源不同的大分子 HSP（ 100kDa以上 )之間不具備相似的生物學(xué)特性，因此不能成為同一個(gè)家族。大多數(shù)熱激蛋白具有分子伴侶（ molecular chaperone）或伴侶蛋白（ chaperonin）的作用，可以和不同功能的多種蛋白質(zhì)形成天然復(fù)合物，參與相關(guān)蛋白質(zhì)的折疊、亞基的組裝、細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸以及蛋白質(zhì)的降解等過程。因此 HSFs可能通過與 HSE的結(jié)合與分離來 控制啟動(dòng) HSP70基因的表達(dá) [6]。太陽(yáng)照射下的果蠅幼蟲和蛹體內(nèi)大量表達(dá)熱激蛋白后，可以抵抗 40℃ 高溫 [8]。攜帶 12種 HSP70原始基因的黑腹果蠅比無(wú) HSP70基因的野生型獲得耐熱性的速度要快很多 [12]。 HSP 作為生物體在各種環(huán)境條件脅迫下誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白質(zhì)，除抵御外 界不良逆境的作用之外，熱激蛋白與類固醇激素受體及蛋白激酶等信號(hào)傳導(dǎo)蛋白相互作用并且形成復(fù)合體，使其具有生物活性，即便是在無(wú)脅迫的條件下， HSP也是真核生物必不可少的 [15]。 雖然溴甲烷和磷化氫等是目前藥材甲等儲(chǔ)藏物害蟲防治較為有效和使用普遍的熏蒸劑，但是前者對(duì)臭氧層有破壞 作用，世界糧農(nóng)組織已決議逐步停止生產(chǎn)和使用，后者由于害蟲抗藥性的產(chǎn)生，其使用受到了局限，更重要的是化學(xué)防治對(duì)環(huán)境的污染和對(duì)施藥者及消費(fèi)者健康的影響，使人們的擔(dān)心和憂慮與日俱增 [18]。實(shí)驗(yàn)以羽化后 2～ 3 d 成蟲作為試蟲。提取的 RNA 樣品置于 80oC 冰箱保存?zhèn)溆?。 反應(yīng)體系（反應(yīng)在液的配制在冰上進(jìn)行） 試劑 體積（ μL） 5PrimeScipt TM Buffer（ for Real Time） PrimeScipt TM RE EnzymeMx I Random 6 mers（ 100μm） Total RNA X（總量不超過 500ng） 反轉(zhuǎn)錄條件： 37oC 15min（反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)）和 85oC 5s(反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng) ) PCR 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)藥材甲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中 HSP 基因的部分序列，利用 Primer Premier 軟件設(shè)計(jì) 2對(duì)特異性引物（表 ）進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，獲得 HSP 全長(zhǎng) 序列。 2 結(jié)果與分析 藥材甲 HSP70 和 HSP90 基因的克隆 SpHSP70 SpHSP70 基因的開放閱讀框 長(zhǎng)度為 1950 bp，編碼 650 個(gè)氨基酸 。 SpHSP90 SpHSP90 基因的開放閱讀框長(zhǎng)度 2169 bp，編碼 723 個(gè)氨基酸 。 貴陽(yáng)學(xué)院畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 14 圖 SpHsp90 基因核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列 (Hsp90 家族的 5 個(gè)保守基序用下劃線標(biāo)出，細(xì)胞質(zhì)型 Hsp90 C端基序（ MEEVD）用雙下劃線標(biāo)注，可能的加尾信號(hào)用灰色盒子標(biāo)注，星號(hào) *表示終止密碼子的位置；加粗阿拉伯?dāng)?shù)字表示氨基酸殘基位置，非加粗阿拉伯?dāng)?shù)字表示核苷酸位置 貴陽(yáng)學(xué)院畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 15 藥材甲 HSP90 和 HSP70 基因系統(tǒng)發(fā)育分析 HSP70 為了理解 HSP70 之間的進(jìn)化關(guān)系，從 NCBI 站點(diǎn)的 GenBank 中下載了其他物種的HSP70 氨基酸序列，與本研究中的 1 個(gè) HSP70 推導(dǎo)的氨基酸序列共同構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹。 圖 采用鄰接法 (Neighbor joining method, NJ 法 )所使用 MEGA 軟件構(gòu)建的藥材甲 HSP70 和HSP90 與其他昆蟲 HSP 的系統(tǒng)進(jìn)化樹 貴陽(yáng)學(xué)院畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 16 第三章 小結(jié)與討論 藥材甲是我國(guó)各地區(qū)重要的儲(chǔ)藏物害蟲，近幾年來該蟲仍在大部分地區(qū)對(duì)各種儲(chǔ)藏物造成嚴(yán)重危害。系統(tǒng)發(fā)育樹的分析中，與 赤擬谷盜Tribolium castaneum,斜紋夜蛾 Spodoptera litura 以及家蠶 Bombyx mori 均在同一支上 ，而Blast 同源性分析的結(jié)果中，與三者的相似度都高達(dá) 92%。這些都充分說明了本研究所得到的藥材甲 HSP70 與HSP90 基因都分別屬于 HSP70 和 HSP90 這兩個(gè)大家族。 感謝我的朋友和同學(xué)，在我寫作論文的過程中給予了我很多的素材，還在論文的撰寫和排版過程中向我提供熱情的幫助。柑橘全爪螨 HSP90基因 cDNA 全長(zhǎng)推導(dǎo)的氨基酸序列具有 5 個(gè)典型的 HSP90 家族特征基序以及細(xì)胞質(zhì)型HSP90 C端基序 [6] 。其氨基酸序列具有 3 個(gè)典型的 HSP70 家族保守基序，一個(gè) ATPGTP 綁定基序、雙組份核定位信號(hào)、非細(xì)胞器 HSP70 特征序列、細(xì)胞質(zhì)型 HSP70 C端基序、典型的四肽重復(fù)序列。然后再與黃粉蟲 Tenebrio molitor（ ）的 TmHSP90 和馬鈴薯葉甲 Leptinotarsa decemlineata（ ），而與雙翅目的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。將該基因的氨基酸序列進(jìn)行 BlastP 分析，結(jié)果顯示與 黃粉蟲 Tenebrio molitor（ ）具有最高相似性，為 92%； 與赤擬谷盜 Tribolium castaneum（ ） 和 馬鈴薯葉 甲 Leptinotarsa decemlineata （ ）都具有較高相似性，為 91%。將該基因的氨基酸序列進(jìn)行 BlastP 分析， ，結(jié)果顯示 SpHSP70 與 中歐山松大小蠹 Dendroctonus ponderosae（ ） 具有最高的相似性，為 95% ； 與 赤 擬 谷 盜 Tribolium castaneum()具有較高的相似性，為 94%；與 斜紋夜蛾 Spodoptera litura（ ） 以及家蠶 Bombyx mori（ NP_0010368921）都具有比較高的相似性，為92%。 NCBI 站點(diǎn)的 ORF Finder（ 查找開放閱讀框， 軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng) 發(fā)育樹，各分支都進(jìn)行 1000 次的重復(fù)檢驗(yàn)。C 冰箱中保存?zhèn)溆?。L）混勻后，加入到 %的電泳膠的上樣孔中， 180V 電壓預(yù)電泳5min，隨后 120V 電壓電泳 20min。1 ℃ 、 RH 75% 177。每頭雌蟲可產(chǎn)卵數(shù)十粒，多數(shù)產(chǎn)在食物表面的褶溝內(nèi)，有時(shí)也可集產(chǎn)十多粒在食物表面。而在傍晚溫度下降、誘導(dǎo)壓力降低時(shí)， HSP70的表達(dá)量也隨之下降 [14]。 熱激蛋白的表達(dá)能使昆蟲快速獲得耐熱性 熱激蛋白基因的存在 還與細(xì)胞獲得耐熱性的速度有關(guān)。 貴陽(yáng)學(xué)院畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 5 圖 人和果蠅體內(nèi) HSPs 合成誘導(dǎo)機(jī)制示意圖（引自 Kiang and Tsokos,1998） 熱激蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)能提高昆蟲的耐熱性 生物體對(duì)熱脅迫最基礎(chǔ)的反應(yīng)就是熱激蛋白的表達(dá)。細(xì)胞質(zhì)中存在熱激轉(zhuǎn)錄因子（ Heat shock transcription factors,HSFs），細(xì)胞在正常情況時(shí) ,細(xì)胞內(nèi) HSP與 HSF結(jié)合，當(dāng)脅迫發(fā)生時(shí)， HSP與變性蛋白結(jié)合 ,HSF從 HSP上分離 ,HSFs被磷酸化 ,然后進(jìn)入細(xì)胞核，與 HSP基因的 HSE結(jié)合，這樣 HSP基因的轉(zhuǎn)錄就開始了，新合成的 HSP與 HSFs結(jié)合，阻止進(jìn)一步合成 HSP。 HSP70家族主要成員有 H