【正文】 數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，這些物種均有 mir430 基因以基因簇的形式存在，但不同的物種 mir430 基因簇的成員不同。 主要的步驟：從 miRBase 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得數(shù)據(jù)，即各物種的 mir430 基因的 成熟 序列 。到目前為止，雖然已經(jīng)有對(duì)于個(gè)別 miRNA 家族進(jìn)化研究的報(bào)道，但總體來(lái)說(shuō)，人們對(duì)于 miRNA 的進(jìn)化特性還知之甚少。在計(jì)算矩陣方面有一些自己的特點(diǎn)： （ 1） 推測(cè)序列或者物種間的進(jìn)化距離 （ 2） 根據(jù) MCL(Maximum Composite Likeliood method)的方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 （ 3） 考慮到了不同堿基替換的不同的比率，考慮到了堿基轉(zhuǎn)換和顛換的差別。 隨著不同物種基因組測(cè)序的快速發(fā)展，產(chǎn)生了大量的 DNA 序列信息，這時(shí)就需要一種簡(jiǎn)便而快速的統(tǒng)計(jì)分析工具來(lái)對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行有效的分析，以提取其中包含的大量信息。 Clustal W 多序列比較模塊中的多序列比較算法依三個(gè)階段順序展開?？梢韵螺d公共數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)于該數(shù)據(jù)庫(kù)的更新和維護(hù)是必 不可少的。先將核酸序列翻譯成蛋白序列（一條核酸序列會(huì)被翻譯成可能的六條蛋白），再對(duì)每一條作一對(duì)一的蛋白序列比對(duì)； BLASTN 是核酸序列到核酸庫(kù)中的一種查詢。 BLAST 軟件的主要功能是： BLAST 對(duì)一條或多條序列 (可以是任何形式的序列 )在一個(gè)或多個(gè)核酸或蛋白序列庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)。 NCBI 還提供了其它數(shù)據(jù)庫(kù)，包括在線人類 孟德爾 遺傳（ OMIM）、三維蛋白結(jié)構(gòu)的分子模型數(shù)據(jù)庫(kù)（ MMDB）、人類 基因序列集成（ UniGene）、 人類基因組 基因圖譜（ GMHG）、生物門類（ Toxonomy) 等數(shù)據(jù)庫(kù)。 NCBI NCBI(美國(guó) 國(guó)立生物技術(shù)信息中心 )理解自然無(wú)聲但精妙的關(guān)于生命細(xì)胞的語(yǔ)言是現(xiàn)代分子生物學(xué)的要求。斑馬魚互補(bǔ) miRNA（ miRNA plement）發(fā)生了很大的變化，依據(jù) Zv9 基因組拼裝對(duì)收錄序列進(jìn)行了合理的調(diào)整，刪除了 26 條斑馬魚序列，并新增了 12 條代表重復(fù)基因位點(diǎn)的序列。新版數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì) miRNA 序列注釋和命名進(jìn)行了系統(tǒng)的修正， miR*命名已經(jīng)終止使用，取而代之的是 5p 和3p 的命名法。 此外 , Nodal 的一個(gè)拮抗劑 lefty 也受到 miR430 的調(diào)控。 miRNA430 的功能和特點(diǎn) miR430基因簇最早在斑馬魚中被發(fā)現(xiàn)，是目前已知的最大的 miRNA基因簇之一。 基于上述觀察，我們認(rèn)為 mir430 存在大規(guī)模串聯(lián)復(fù)制現(xiàn)象。我們發(fā)現(xiàn)該基因家族由祖先基因經(jīng)次整體復(fù)制伴隨一次片段復(fù)制而形成，我們的發(fā)現(xiàn)為基因組整體復(fù)制及片段復(fù)制同時(shí)作用而導(dǎo)致 miRNA 家族擴(kuò)增提供了證據(jù)。研究表明，在果蠅基因組中約占總數(shù)一半的 miRNA 基因具有成簇排列的特征。 miRNA 參與的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控可能是造成的基因表達(dá)模式差異的重要原因，因此， miRNA 基因進(jìn)化保守性以及多樣性可能對(duì)物種進(jìn)化及不同物種間的表型差異起到重要的推動(dòng)作用?；谶@一前提，目前已有多項(xiàng)研究對(duì) miRNA 對(duì)靶基因表達(dá)穩(wěn)定效應(yīng)進(jìn)行了初步分析。 miRNA 對(duì)靶基因表達(dá)的整體調(diào)節(jié)作用 Lim 等人于 2020 年首次報(bào)道了人類 miRNA 對(duì)靶基因表達(dá)譜的作用，將組織特異性表達(dá)的 miRNA,miRl 與 miR124，轉(zhuǎn)導(dǎo)至 hela 細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)對(duì) hela 細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)前后全基因組表 達(dá)譜對(duì)照分析，發(fā)現(xiàn)分別有上百個(gè)蛋白編碼基因在 miRNA導(dǎo)入 hela 細(xì)胞后表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)，其中多數(shù)基因 3UTR 存在與 miRNASeed區(qū)域互補(bǔ)序列，充分說(shuō)明動(dòng)物中 miRNA可直接導(dǎo)致靶基因 mRNA表達(dá)水平降低。它的最大優(yōu)點(diǎn)是高精度定量與高靈敏度。 （ 2）生物信息學(xué)方法 生物信息學(xué)方法 是依據(jù)在不同的物種中，成熟的 miRNA 具有較大的序列同源，前體的莖環(huán)結(jié)構(gòu)具有相當(dāng)大的保守性，其結(jié)構(gòu)和序列的熱力學(xué)穩(wěn)定性與已知miRNA 具有相似性，以及 miRNA 在基因組中往往是成簇排列的這一特征在基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索新的 miRNA 基因。植物 miRNA 同靶基因配對(duì)完美，而且它們的互補(bǔ)位點(diǎn)可以南京郵電大學(xué) 2020 屆本科生畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 6 位于靶基因轉(zhuǎn)錄區(qū)域，而不是限制在 339。這說(shuō)明 miRNA在實(shí)體腫瘤的癌癥發(fā)病機(jī)理中發(fā)揮著重要的作用。 近年來(lái) ， 關(guān)于 miRNA 的研究已經(jīng)從識(shí)別 miRNA、闡明其作用機(jī)制，轉(zhuǎn)移到鑒定其功能。 Lee 等 人證明其中一大類 miRNA 由多聚酶Ⅱ (PolⅡ )轉(zhuǎn)錄 ,，而且一些 miRNA 的轉(zhuǎn)錄本 (如 let7)具有5′帽和 3′poly(A)的結(jié)構(gòu)。 miRNA命名規(guī)則 由于發(fā)現(xiàn)的 miRNA 數(shù)量眾多，為防止混淆，除最早發(fā)現(xiàn)的 lin4， let7 及 lsy6之外，研究者們對(duì)于其他 miRNA 統(tǒng)一用 miR(為數(shù)字 )表示，其基因則記為mir(為相應(yīng)數(shù)字 )。 通過(guò)高通量表達(dá)譜分析表明 ， 動(dòng)物 miRNA對(duì)多個(gè) mRNA同時(shí)產(chǎn)生降解作用，造成靶基因 mRNA 表達(dá)水平的不同程度的下降也可能是一種普遍的現(xiàn)象。其中的一條或兩條鏈同時(shí)作為成熟的 miRNA 分子與蛋白質(zhì)結(jié)合形成核糖核蛋復(fù)合體 miRNP，或稱為 RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合物，其后 miRNA 通過(guò)與靶基因mRNA3’UTR 區(qū)互補(bǔ)配對(duì)，發(fā)揮基因表達(dá)調(diào)控作用。預(yù)計(jì)在人類基因組中編碼的 miRNA 分子的基因總數(shù)可能占到基因總數(shù)的 23%，它們可能多種物學(xué)過(guò)程中扮演了重要的角色。 Lin4 基因不編碼蛋白 ， 而是產(chǎn)生一種小分子 RNA， 這種小分子 RNA 能與靶 mRNA 的 3’UTR 相互作用，從而抑制 Lin14基因表達(dá)。根據(jù)這一原理，RNA 分子在生命過(guò)程中主要起信息傳遞，指導(dǎo)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的作用。 利用 MEGA ，以 mir430基因簇中的 mir430成員 成熟 序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。通常多個(gè) miRNA 基因在染色體上聚集排列形成 miRNA 基因簇，這些 miRNA 基因簇在不同物種中有較高的保守性， miRNA 基因簇在功能上比單個(gè) miRNA 的作用更高效，對(duì) miRNA 基因簇進(jìn)行研究，有利于深入了解 miRNA 所參與的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。對(duì)本研究做出過(guò)重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明 并表示了謝意 。 主要的步驟：從 miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得數(shù)據(jù)，即 已知 的 mir430基因的 成熟 序列。ClustalW。目前已在多個(gè)門類的生物中發(fā)現(xiàn) miRNA 的存在，包括植物、動(dòng)物、某些病毒和藻類等。目前己有數(shù)以千計(jì)的 miRNA 在不同物種中被發(fā)現(xiàn)。在細(xì)胞核中，初級(jí)轉(zhuǎn)錄本在輔助因子 DGCR8 幫助下被核酸酶 Drosha 加工成長(zhǎng)度約為 6080nt 的非完全互補(bǔ)莖 環(huán)結(jié)構(gòu)，稱為前體 miRNA。已證實(shí) miRNA 主要存在兩種不同的作用機(jī)制：降解 mRNA 或抑制 mRNA 翻譯。該發(fā)夾結(jié)構(gòu)必須具有最低的能量狀態(tài) ,并且在發(fā)夾結(jié)構(gòu)的其中一條臂上必須含有22 核普酸中的至少 16 個(gè)，預(yù)測(cè)的前體 miRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)中不應(yīng)該有大的內(nèi)部環(huán)、泡等結(jié)構(gòu)。 之后人們又對(duì)命名規(guī)則作了補(bǔ)充。能與 exportin5 結(jié)合的 premiRNA 必須具有大于 16nt 配對(duì)的莖和 3′末端有 2 個(gè)懸垂堿基的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。UTR 內(nèi)的一個(gè)點(diǎn)突變產(chǎn)生了一個(gè)可以在骨骼肌內(nèi)高度表達(dá)的兩個(gè) miRNA，即 miR1 和 miR206，它們同時(shí)作用的靶位點(diǎn)，從而引起 miRNA 介導(dǎo)的 myostain 濃度在轉(zhuǎn)錄后降低而造成肌肉造成肌肉肥大；Chen 等證實(shí)， miR1 通過(guò)作用于 HDAC4 而促成肌細(xì)胞分化為成熟的肌肉細(xì)胞，抑制細(xì)胞擴(kuò)增， miR133 則通過(guò)抑制 SRF 而促進(jìn)成肌細(xì)胞擴(kuò)增，抑制其分化。動(dòng)物 miRNA 的負(fù)調(diào)控功能不僅局限于抑制靶基因轉(zhuǎn)錄， Brennecke 等利用人工構(gòu)建的與 Bantam 完全互補(bǔ)的靶基因，證實(shí) 了動(dòng)物 miRNA 一樣可以引起靶基因的降解。 （ 1） cDNA 文庫(kù)法 該方法是首先從細(xì)胞組織中提取總 RNA，用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行大小分級(jí)，回收大小在 20~25 個(gè)核苷酸的 RNA 分子，利用 T4 連接酶，直接將人工合成的 5′和 3′接頭連接到 RNA 上后，用 PCR 反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增這些序列，獲得 miRNAs 的 cDNA 文庫(kù)，再將這些 cDNA 進(jìn)行克隆、測(cè)序，然后用生物信息學(xué)軟件對(duì)其進(jìn)行基因組中定位，并驗(yàn)證是否具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體以及該發(fā)夾結(jié)構(gòu)在其它物 種中的保守性，最后將具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的小分子 RNA 進(jìn)行 Northern 雜交等以檢測(cè)其表達(dá)情況，最終將符合 miRNA 標(biāo)準(zhǔn)的小分子 RNA 鑒定為新的 miRNA。 另一種有效方法是通過(guò)研究已知 miRNA 的臨近序列來(lái)發(fā)現(xiàn) miRNA，因?yàn)樵S多 miRNA 都是成簇排列的或距離很近。研究表明，蛋白編碼基因的表達(dá)在不同細(xì)胞、組織及不同的環(huán)境狀況下具有極大的差異，其表達(dá)狀況可能受到各種內(nèi)在因素，如分子伴侶調(diào)控，以及其他外在環(huán)境因素的影響。 miRNA 對(duì)靶基因表達(dá)調(diào)控的傾向性 Yu 等人 [14]采用與 Lim 與 Sood 等類似的方法，大規(guī)模分析 miRNA 對(duì)靶基因表達(dá)的影響，除進(jìn)一步證實(shí)胚胎期蛋白編碼基因表達(dá)量由于 miRNA 的影響，較成年組織有所下降之外，還發(fā)現(xiàn) ,miRNA 更傾向于調(diào)控在多種組織中普遍表達(dá)的基因。為今后進(jìn)一步研究 miRNA 及轉(zhuǎn)錄因子對(duì)靶基因調(diào)控作用機(jī)制帶來(lái)新的啟示。在對(duì) miRNA 基因在染色體上分布分析后發(fā)現(xiàn)，許多 miRNA 在染色體上成簇排列?；蚪M復(fù)制和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo) miRNA 基因復(fù)制可能是除除串聯(lián)重復(fù)之外導(dǎo)致其 miRNA 基因家族形成的重要原因。序列比對(duì)結(jié)果表明，這些復(fù)制基本單元 (包括premiRNA 和它們之間的序列?？紤]到mir430 所有 miRNA 都擁有相同的種子區(qū)，我們推測(cè)這些系特異性的大規(guī)模復(fù)制之所以被選擇，是因?yàn)樗鼈兡茉谖丛黾愚D(zhuǎn)錄本的情況下 (以多順發(fā)子的形式轉(zhuǎn)錄 )大大增加 miRNA 分子的數(shù)量，從而加快從母源調(diào)控向合子調(diào)控的轉(zhuǎn)換過(guò)程。 mir430 簇特異性的大規(guī)模復(fù)制，是因?yàn)樗鼈兡茉谖丛黾愚D(zhuǎn)錄本的情況下 (以多順發(fā)子的形式轉(zhuǎn)錄 )大大增加 miRNA 分子的數(shù)量 , 從而加快從母源調(diào)控向合子調(diào)控的轉(zhuǎn)換過(guò)程，據(jù)此我們可以部分地解釋該超家族中的其它 miRNA 成簇出現(xiàn)的現(xiàn)象。miRBase 提供便捷的網(wǎng)上查詢服務(wù)，允許用戶使用關(guān)鍵詞或序列在線搜索已知的miRNA 和靶標(biāo)信息。在新版本中，發(fā)夾前體序列升至 18226 條，新增 1488 條；成熟 miR 和 miR*產(chǎn)物共 21643 條，新增 1929 條；新版本報(bào)道序列共涵蓋個(gè) 168 個(gè)物種。 ? 7 個(gè)動(dòng)物物種： Anolis carolinensis [綠安祿蜥 ] (282)， Macropus eugenii [尤金袋鼠 ] (2)，Sarcophilus harrisii [袋獾 ] (67)， Rhipicephalus microplus [微小扇頭蜱 ] (24)， Ascaris suum [豬蛔 蟲 ] (97)， Glottidia pyramidata (1)， Terebratulina retusa (1)。 NCBI 的項(xiàng)目包括四項(xiàng)任務(wù)：建立關(guān)于分子生物學(xué)，生物化學(xué)，和遺傳學(xué)知識(shí)的存儲(chǔ)和分析的自動(dòng)系統(tǒng)；實(shí)行關(guān)于用于分析生物學(xué)重要分子和復(fù)合物 的結(jié)構(gòu)和功能的基于計(jì)算機(jī)的信息處理的，先進(jìn)方法的研究；加速生物技術(shù)研究者和醫(yī)藥治療人員對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)和軟件的使用；全世界范圍內(nèi)的生物技術(shù)信息收集的合作努力。 BLAST 軟件 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)是一套在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)或 DNA數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行相似性比較的分析工具。所查詢的序列和調(diào)用的數(shù)據(jù)庫(kù)則可以是任何形式的組合 ， 既可以是核酸序列到蛋白庫(kù)中作查詢 ， 也可以是蛋白序列到蛋白庫(kù)中作查詢 ， 反之亦然。假如是作核酸－核酸查詢，有兩種 BLAST 供選擇，通常默認(rèn)為 BLASTN。比對(duì)過(guò)程中，相似性程度較高的序列先進(jìn)行比對(duì)，而距離較遠(yuǎn)的序列添加在后面。 MEGA 軟件 MEGA 的全稱是 Molecular Evolutionary Geics Analysis 分子進(jìn)化遺傳分析。使用它我們可以編輯序列數(shù)據(jù)、序列比對(duì)、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹、推測(cè)物種間的進(jìn)化距離等。絕大部分miRNA 都被認(rèn)為是高度保守的。同時(shí) , 我們觀察到 miRNA 有系特 異性 (lineagespecific)的大規(guī)模復(fù)制現(xiàn)象，以及 miRNA 在串連復(fù)制后，旁系同源的 miRNA 前體可能會(huì)選擇其發(fā)卡環(huán)不同臂上的序列作為成熟體，從而大大增加了 miRNA 新功能產(chǎn)生的可能性。 南京郵電大學(xué) 2020 屆本科生畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 18 數(shù)據(jù)與方法 數(shù)據(jù) 由于 mibase 數(shù)據(jù)庫(kù)中存在大量的基因數(shù)據(jù)，可以供我們使用。 利用。 利用 MEGA 軟件，以 mir430 基因簇中的 mir430 成員 成熟序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹 。在本文中，我們以一個(gè) miRNA430為線索，研究 ,miRNA 的部分進(jìn)化特性。并且，隨著生物信息學(xué)的預(yù)測(cè)方法、原位雜交、過(guò)量表達(dá)、基因沉默技術(shù)等的發(fā)展，一些 miRNA 的功能已經(jīng)得到確認(rèn)。 現(xiàn)在我們使用的是 MEGA4 的版本。它的輸出格式可以是Clustal 格式，也可以