【正文】 有關(guān) GbEDS1和棉花抗黃萎病的關(guān)系有待進(jìn)一步驗(yàn)證。 圖 6 GbEDS1的氨基酸跨膜區(qū)段預(yù)測 Fig. 6 Prediction of transmembrance region of GbEDS1 amino acid sequence GbEDS1 的亞細(xì)胞定位預(yù)測 利用 PSORT 網(wǎng)站 PSORT Prediction of Protein Localization Sites version (WWW) （ GbEDS1 基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測，結(jié)果顯示（圖 7）， GbEDS1 蛋白可能位于細(xì)胞微體（過氧化物酶體）上。12:PCR產(chǎn)物 . GbEDS1 基因 5′端和 3′端序列的克隆 通過 5′RACE和 3′RACE反應(yīng)分別獲得了約 1500bp的 5′端片段和 750bp的 3′端片段 （ 圖 3），通過 pMD19T載體克隆測序后 ， 經(jīng)序列拼接獲得 GbEDS1基因 cDNA全長序列。 GbEDS1 保守 序列的分離 (1) 利用已經(jīng)發(fā)表的其他物種上相關(guān)基因的序列， 采用 Blast 程序 在 NCBI 網(wǎng)站進(jìn)行棉花 EST 數(shù)據(jù)庫比對 ，尋找出高度同源的序列，將同源序列進(jìn)行拼接組裝成重疊群(contig)； (2) 以重疊群為種子序列，再次 Blast 檢索棉花的 EST 數(shù)據(jù)庫和序列組裝，延伸重疊序列，重復(fù)上述過程，直到?jīng)]有新的 EST 檢出即重疊群序列不再 延伸，從而生成最終的最長的新生序列，作為種子序列的延伸產(chǎn)物； 據(jù)種子序列的延伸產(chǎn)物，設(shè)計(jì)相關(guān)引物，并且到相應(yīng)的棉花材料中檢驗(yàn)延伸序列的真實(shí)性。然后在無菌水中浸泡 36h，置于預(yù)先配好的 MS 培養(yǎng)基中，采用光照 16h/黑暗 8h，晝溫 28℃ ，夜溫 25℃ 培養(yǎng)?；诖?，本研究將根據(jù)不同物種的 EDS1 核苷酸保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡并引物，通過 RTPCR和 RACE 技術(shù)克隆海島棉抗黃萎病相關(guān)基因 GbEDS1 并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。 EDS1（ enhanced disease susceptibility 1） 基因在 1999 年被首次克隆 [5, 6]，研究表明， EDS1 是煙草中 RPS4 調(diào)節(jié)的過敏反應(yīng) HR 所依賴的一個(gè)信號元件 [7]；番茄中 Ve1 介導(dǎo)的對大麗輪枝菌的抗性反應(yīng)依賴于 EDS1 和 NDR1[8, 9]；葡萄 EDS1 基因具有抗白粉病的作用 [10]。 生物信息學(xué)分析 Molecular Cloning and Bioinformatics Analysis of GbEDS1 Related with Verticillium Wilt Resistance from Gossypium barbadense Author:Liu Tong Major: Agronomy Abstract: Degenerate primer was designed according to conserved domains of Enhanced Disease Susceptibility1 (EDS1) from different species. Opening reading frame and cDNA sequences of GbEDS1 related to Verticillium wilt resistance was isolated by RTPCR and RACE technologies. The 2190bp cDNA sequence of GbEDS1 contained a 168bp 5′UTR and a 174bp 3′UTR， as well as an open reading frame of 1848bp encoding a 615 amino acids. The identity of the nucleotides between GbEDS1 and EDS1 of poplar (XM002322106) was 64%. No signal peptide was in the amino acid sequence. Keywords: Cotton。 回答問題 10 思維敏捷，邏輯性強(qiáng)，準(zhǔn)確流利地回答各種問題。 論文不足之處在于： （ 1）前言部分過于繁瑣，可以刪去與研究內(nèi)容相關(guān)不大的部分； （ 2）文章參考文獻(xiàn)格式尚需進(jìn)一步修改； 成 績 評 定： 是否同意答辯： 指導(dǎo)教師（簽名）： 年 月 日 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 本科畢業(yè)論文答辯評分表 評分指標(biāo) 分 值 評 價(jià) 內(nèi) 容 得 分 論文選題 10 選題有重要理論意義或?qū)嵱脙r(jià)值。 指導(dǎo)教師： 2020年 9 月 30 日 審 核 小 組 成 員 姓 名 職 稱 備 注 姓 名 職 稱 備 注 王省芬 教授 李文龍 講師 劉立峰 教授 李志坤 副教授 李喜煥 副教授 開題報(bào)告記錄： 棉花 RNA 提取過程如何防止其降解？ 基因克隆過程中如何避免基因組的干擾？ 審核小組評語： 論文選題依據(jù)比較充分，試驗(yàn)設(shè)計(jì)比較合理，研究方法可行，工作量較大，研究結(jié)果對于棉花黃萎病抗性的改良具有一定理論意義和應(yīng)用前景。 a) GbEDS1 基因的氨基酸序列分析； b) GbEDS1 的親疏水性分析； c) GbEDS1 的信號肽分析。所以，可以把這些基因用于棉花抗病基因工程育種，通過它們的過量表達(dá)來提高棉花中萜類物質(zhì)的含量，把上面的基因單獨(dú)或一同轉(zhuǎn)入棉花中來介導(dǎo)并提高棉花對黃萎病的抗性。最近，一些研究者從海島棉品種中構(gòu)建了用于抗黃萎病基因的克隆及其相關(guān)研究的文庫 [3, 4]?；诖耍狙芯繉⒏鶕?jù)不同物種的 EDS1 核苷酸保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡并引物，通過 RTPCR 和 RACE技術(shù)克隆海島棉抗黃萎病相關(guān)基因 GbEDS1 并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。 EDS1（ enhanced disease susceptibility 1） 基因在 1999 年被首次克隆 [5, 6]，研究表明，EDS1 是煙草中 RPS4 調(diào)節(jié)的過敏反應(yīng) HR 所依賴的一個(gè)信號元件 [7]；番茄中 Ve1 介導(dǎo)的對大麗輪枝菌的抗性反應(yīng)依賴于 EDS1 和 NDR1[8, 9]；葡萄 EDS1 基因具有抗白粉病的作用 [10]。 完成畢業(yè)論文的撰寫。 可能存在的問題 從棉花樣品中高效地提取完整的 RNA，由于其植物體內(nèi)多糖多酚含量高，給提取帶來難度?？裹S萎病基因的研究能為品種改良提供依據(jù)，具有顯著的學(xué)術(shù)理論價(jià)值和潛在經(jīng)濟(jì)價(jià)值。 本研究利用 RTPCR和 RACE技術(shù)從海島棉克隆抗黃萎病相關(guān)基因 EDS1的 cDNA及開放閱讀框序列（ Open reading frame， ORF） ， 并通過生物信息學(xué)分析，以預(yù)測該基因在棉花抗黃萎病過程中所起的作用，為基因功能驗(yàn)證提供理論依據(jù)。 進(jìn)度安排： : 查找國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，學(xué)習(xí)與本試驗(yàn)有關(guān)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)， 制定實(shí)驗(yàn)方案。 完成畢業(yè)論文的答辯。 EDS1 誘導(dǎo)了 R 基因控制的抗性，即調(diào)節(jié)了活性氧的爆發(fā)及 HR 反應(yīng)的表達(dá)，并且通過在侵入位點(diǎn)積累水楊酸（ Salicylic Acid, SA）的方式增強(qiáng)了對病原菌的抵抗作用 [11, 12]。研究結(jié)果將為棉花抗黃萎病育種提供重要基因 資源，為解析黃萎病抗性機(jī)制提供理論依據(jù)。 目前，棉花抗黃萎病基因工程中應(yīng)用的基因主要有幾丁質(zhì)酶、 β1， 3葡聚糖酶、植物防衛(wèi)素、硫素及葡萄糖氧化酶 (Glucose oxidase， GO)等外源抗病基因 [5]。 參考文獻(xiàn) [1] Zhou, Xiang, Jun Lu, Shan, et al. A cotton cDNA (GaPR10) encoding a pathogenesis related protein with in vitroribonuclease activity Science, 2020, 162 (4): 629637. [2] 竇道龍 . 棉花抗黃萎病基因工程研究和防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)基因的克隆 , 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 博士研究論文 , 2020 [3] 左開井 , 吳菲 , 唐克軒等 . 海島棉品種根部黃萎病菌誘導(dǎo)表達(dá)全長 cDNA 文庫 . 棉花學(xué)報(bào) , 2020, 14 (5) : 291294. [4] Neumann M J, Dobinson K F. Sequence tag analysis of gene expression during pathogenic growth and microsclerotia development in the vascular wilt pathogen Verticillium dahliae Fungal Geics amp。 (3) GbEDS1 序列與其他物種 EDS1 同源比對分析。同意進(jìn)入下一階段的試驗(yàn)。立題依據(jù)充分。 總 分 100 注：本表為答