【正文】 ............. 7 材料 ................................................................... 7 試驗動物 ........................................................... 7 實驗材料 ........................................................... 7 主要試劑的來源 ...................................................... 7 主要儀器設備 ........................................................ 8 主要試劑的配置 ...................................................... 8 主要分子生物學軟件 ................................. 錯誤 !未定義書簽。 在波爾山羊中， 檢測到 AA、 GG 兩種基因型，未檢測到 AG 型 ；其中 AA 基因型個體在出現(xiàn)頻率最高 ， 為 ， GG 型為 ； A、 G 等位基因頻率分別為 和 。 、作用機制； 褪黑激素 對生殖系統(tǒng)作用的機理主要是通過光作用于視網(wǎng)膜 ， 然后通過視網(wǎng)膜 下視丘至視交叉上核 ， 再經(jīng)過一系列復雜的神經(jīng)交換至頸上神經(jīng)節(jié) ， 其節(jié)后交感神經(jīng)作用于松果體。 2．褪黑激素受體類型、作用機制； 褪黑激素受體屬于 G 蛋白耦聯(lián)受體家族 。 Messer 等（ 1997） 和 Notter 等 （ 20xx） 用 M n lⅠ 和 R saⅠ 酶分別對白面雜種羊、薩福克羊、特克塞爾羊、柯泊華斯羊和合成系綿 羊群體 M TNR1A 基因外顯子 2 的 824 bp擴增產(chǎn)物進行消化 ， 發(fā)現(xiàn) M n lⅠ在 5 個綿羊群體中都存在 286 bp 和 236 bp多態(tài)片段 ， R saⅠ都存在 295 bp 和 290 bp 多態(tài)片段。但是，對于山羊，只有對產(chǎn)絨或營養(yǎng)調(diào)控的研究，目前尚未發(fā)現(xiàn)有對山羊繁殖性能影響的相關報道。 頸靜脈采血 10ml/只， EDTA 抗凝， 20℃ 保存。高壓滅菌，室溫保存 ； 2) EDTA（ pH=） ： 稱取 Na2EDTA 用于基因組 DNA提取的溶液的配制 1) 蛋白酶 K： 稱取 200mg蛋白酶 K溶于 10ml雙蒸水，以 1ml分裝， 20℃ 冷凍保存 ； 2) 氯仿 /異戊醇（ 24:1） ： 量取 480ml氯仿，加入 20ml異戊醇，混勻 ； 3) 3M NaAc： 稱取 NaAc 用于瓊脂糖凝膠電泳及檢測溶液的配制 1) 50TAE 儲備液 ： 稱取 242g Tris堿溶于 750ml雙蒸水中，加入 HAc、100ml EDTA（ pH＝ ），加水定容至 1000ml； 2) 5TBE 儲備液 ： 稱取 54g Tris堿和 750ml雙蒸水中，加入 20ml EDTA（ pH＝ ），加水定容至 1000ml； 3) 6 上樣緩沖液 ： %溴酚蘭， %二甲苯青， 15%Ficoll聚蔗糖 ； 4) 溴化乙錠（ EB， 10mg/ml） :100ml雙蒸水中加入 EB，攪拌使完全溶解，轉(zhuǎn)入棕色試劑瓶，錫箔包裹。 擴增及其電泳檢測 PCR擴增反應體系 （ 表 2） 表 2 PCR 擴增反應體系 （ 20μ l） Table 2 PCR amplification of the response system （ 20μ l） 反應體系 response system 反應體積 V（μ l） response volume（μ l） 滅菌蒸餾水 10 Buffer 2 Mg2+ dNTP 上游引物 下游引物 Taq DNA 聚合酶（ 5 U/ml） 模板 DNA 1 Total 20 退火溫度的優(yōu)化 利用 PCR 機器上都有一個 Gradient 功能，在一次 PCR 過程中，對機器中不同位點的反應采用不同的退火溫度，一般在第一次實驗中，采用引物溶點上下華中農(nóng)業(yè)大學本科畢業(yè)論文（或設計） 11 10 度設置退火溫度 梯度 。 瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR 擴增產(chǎn)物用 %瓊脂糖凝膠電泳檢測， EB 染色，利用 BIORAD 凝膠成相系統(tǒng) 凝膠成像系統(tǒng)進行成像分析，記錄結果并拍照。取一燒杯，放入： 瓊脂糖 g； 1T AE 50 ml。待冷卻成膠。使比重較大的樣品自然沉入上樣孔底。 成像分析 利用 BIORAD 凝膠成相系統(tǒng) 凝膠成像系統(tǒng)進行成像分析，記錄結果并拍照。 基因頻率與基因型頻率使用軟件 進行統(tǒng)計分析，不同基因型對產(chǎn)羔數(shù)的最小二乘均值分析使用 SAS（ 版） GLM（ General Linear Model） 軟件包進行，模型如下： Yijkl=μ +Gi+Pi+eijk Yijkl為產(chǎn)羔數(shù)，μ為群體均值， Gi為基因型效應， Pi為胎次效應， eijk為隨機效應。 酶切圖譜見圖 3 。研究表明：波爾山羊的 A等位基因可能與山羊頭胎產(chǎn)羔數(shù)呈正相關，該位點主要以加性方式起作用。并有多個研究結果表明， 褪黑激素受體 1A 基因與品種 Breed 數(shù)量 N 基因型 Geype 最小二乘均值177。 基因型 Geype 最小二乘均值177。 華中農(nóng)業(yè)大學本科畢業(yè)論文（或設計） 17 綿羊的繁殖性狀有著緊密的關聯(lián)。馬頭山羊是湖北省本地品種，長期閉鎖選育 ， 湖北馬頭山羊具有個體大、生長快、繁殖率高等特點 ，其全年均可發(fā)情，母羊一年產(chǎn) 2 胎，年產(chǎn)羔率 428%， 平均窩產(chǎn)羔數(shù) 頭， 馬頭山羊 繁殖力遠遠高于全國其它地方良種山羊品種 （ 楊利國，20xx）。 參考文獻 [1] 滑國華．山羊繁殖性狀五個候選基因多態(tài)性及其與產(chǎn)羔數(shù)性狀關聯(lián)分析．［碩士學位論文］．武漢：華中農(nóng)業(yè)大學圖書館， 20xx [2] 吳偉生．抑制素基因作為山羊多胎性侯選基因的研究．［碩士學位論文］．武漢：華中農(nóng)業(yè)大學圖書館， 20xx [3] 周文然 ， 儲明星 ， 孫少華等． 小尾寒羊高繁殖力候選基因 INHA 的研究 ． 農(nóng)業(yè)生物技術學報 ,20xx,15(1)： 3236 [4] 陳桂芳 ， 李齊發(fā) ， 強巴央宗等．西藏牦牛和黑白花奶牛生長激素基因 AluⅠ多態(tài)性的比較研究． 畜牧與獸醫(yī) ， 20xx， 35： 11 [5] 儲明星，程篤學，劉文忠． 褪黑激素受體 1A基因外顯子 2與小尾寒羊高繁殖力的關聯(lián) ． 安徽農(nóng)業(yè)大學學報 ， 20xx， 35 (1) ： 124 [6] 王林楓． 光照和埋植褪黑激素對內(nèi)蒙古白絨山羊含氮物質(zhì)分配和產(chǎn)絨性能的影響及調(diào)控的研究 ．［碩士學位論文］．內(nèi)蒙古：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學圖書館， 20xx [7] 閆守慶 ,王慧芳 ,祝萬菊． 藍狐與銀狐褪黑激素受體 1A基因的克隆及序列分析 ． 中國畜牧獸醫(yī) ， 20xx， 35： 3 [8] 季從亮，儲明星，陳國宏． 4 個綿羊品種褪黑激素受體 1a 基因第二 外顯華中農(nóng)業(yè)大學本科畢業(yè)論文（或設計） 18 子 PCR— RFLP 分析．華中農(nóng)業(yè)大學學報， 20xx， 4（ 22）： 2 [9] 郭玉強 ,蔡國寶 ,劉艷婷等．褪黑激素對綿羊季節(jié)性繁殖的調(diào)控機理．甘肅畜牧獸醫(yī)， 20xx， 1： 198 [10] 張凱，文勇立，李學偉等． 褪黑激素受體基因表達的研究進展 ．四川生理科學雜志 ， 20xx。 同時還感謝實驗室的各位師兄師姐給我耐心的指導和講解，感謝與我一起做實驗的畢業(yè)生同學的關心和鼓勵！