【正文】 除經(jīng)典的 Taq酶外，還陸續(xù)發(fā)現(xiàn)下列耐熱酶 1） Tth DNA聚合酶： **從 Thermus thermophilus HB8中提取而得 **該酶在高溫和 MnCl2條件下，能有效地 逆轉(zhuǎn)錄 RNA **當(dāng)再加入 Mg 2+后，該酶的聚合活性大大增加 SO，逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA與 DNA的 擴(kuò)增可用同一種酶催化 即該酶適用于 RTPCR 2） pfu DNA 聚合酶 ? 是從 Pyrococcus furiosis中精制而成的高保真耐高溫 DNA聚合酶，它不具有 5’3’外切酶活性，但具有 3’5’外切酶活性，可 校正PCR擴(kuò)增過程中產(chǎn)生的錯(cuò)誤，使產(chǎn)物的堿基 錯(cuò)配率極低， 催化 DNA的 忠實(shí)性 比 Taq DNA聚合酶 高 12倍 ? PCR產(chǎn)物為 平端（ 無 3’端突出的單 A核苷酸） 3） Vent DNA聚合酶 *是從 Litoralis棲熱球菌中分離出的 *不具有 539。外切酶活性，可以去除錯(cuò)配的堿基， 具有校對(duì)功能 *可擴(kuò)增 12kb的模板 DNA 對(duì) PCR所用的聚合酶的選擇原則和參考信息 （自學(xué)，了解） TaKaRa PCR Enzymes TaqTM 1） 用于 1～ 2 kbp以下的 DNA片段的 PCR擴(kuò)增 2） 比較經(jīng)濟(jì)的 PCR用 DNA聚合酶 3） 適用于一般的 PCR擴(kuò)增或檢測(cè) Ex TaqTM 1） 用于 15 kbp以下的 DNA片段的 PCR擴(kuò)增 2）融合了 LA PCR技術(shù) 3） 可信度是 TaKaRa TaqTM 的 3～ 4倍 4）從擴(kuò)增靈敏度、擴(kuò)增量、 PCR條件的通用性考慮，是一種萬能型 PCR用 DNA 聚合酶 LA TaqTM 1）用于 10 kbp以上的 DNA片段的 PCR擴(kuò)增 2） 融合了 LA PCR技術(shù) 3） 可信度是 TaKaRa TaqTM 的 7倍 4） 適于擴(kuò)增富含 GC或復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的 DNA（用 GC Buffer） DNA Polymerase 1）高保真性（ High Fidelity）：與 Pfu、 Vent DNA聚合酶相同，可信度是 TaKaRa TaqTM的 10倍以上 2）良好的擴(kuò)增性能：與 TaKaRa TaqTM有相同的擴(kuò)增性能（優(yōu)于 Pfu、 Vent DNA聚合酶） TaKaRa PCR Enzymes TaKaRa PCR Enzymes ZTaqTM 1）反應(yīng)速度快，是 TaKaRa TaqTM的 5倍 2）擴(kuò)增性能良好，與 TaKaRa Ex TaqTM 相同 3）可信度高，是 TaKaRa TaqTM 的 3～ 4倍 DNA Polymerase的可信度比較 TaKaRa PCR 酶的性能比較 PCR時(shí)酶的選用 引物： 與靶基因兩側(cè)互補(bǔ) 的 寡核苷酸 ，其本質(zhì)是單鏈 DNA，它決所得擴(kuò)增產(chǎn)物的 特異性 和 長(zhǎng)度 （ 1） 引物長(zhǎng)度 ： 1840nt,常用 2024nt **至少 18nt,這樣才能保證擴(kuò)增反應(yīng)的 特異性 **太長(zhǎng)，則致退火時(shí)引物與模板結(jié)合不充分， 擴(kuò)增產(chǎn)物減少 3） 引物（ primer)及其濃度 （ 2） 引物跨度 ：以 200500bp為宜 特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至 10kb的片段 （ 3） 引物序列 ：除 與靶序列兩側(cè)匹配 外，還應(yīng)與核酸數(shù)據(jù)庫的其它序列 不匹配 (無明顯同源性） （ 4） 引物濃度 ：一般 是 ?mol/L。胡德現(xiàn)任 CNSI董事、美國(guó)納斯達(dá)克上市公司董事，他還是美國(guó)國(guó)家科學(xué)院 (NAS)院士、美國(guó)學(xué)者協(xié)會(huì)會(huì)員、美國(guó)科學(xué)藝術(shù)學(xué)院院士 5 PCR技術(shù)簡(jiǎn)史 ? 核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想 ? 聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明 *1983年 ， 美國(guó) PECetus公司的 Mullis等人發(fā)明了在 試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的 DNA復(fù)制 ， 即聚合酶鏈反應(yīng) （ PCR） ，1985年發(fā)表相關(guān)文章 *最初采用大腸桿菌 DNA聚合酶的 klenow片段進(jìn)行 PCR， 該 酶不耐熱 ， 致該過程 耗時(shí) 、 費(fèi)力 、 且易出錯(cuò) ? 由于 Klenow酶不耐熱，在 DNA模板進(jìn)行熱變性時(shí)，會(huì)導(dǎo)致此酶鈍化， 每加入一次酶只能完成一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)周期 ，給 PCR技術(shù)操作程序添了不少困難 ? 這使得 PCR技術(shù) 在一段時(shí)間內(nèi) 沒能 引起生物醫(yī)學(xué)界的足夠 重視 ? 1988年才木 (Saiki) 等從 嗜熱水生桿菌(Thermus aquaticus) 中提取到一種耐熱 DNA聚合酶，命名為 Taq DNA聚合酶 其用于 PCR時(shí)，在熱變性后不會(huì)被鈍化， 不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加新酶， 大大提高了擴(kuò)增片段 特異性和擴(kuò)增效率 ，也增加了擴(kuò)增 長(zhǎng)度（ ） Thermus aquaticus A hot spring in Yellowstone National Park 5 PCR技術(shù)簡(jiǎn)史 ? 核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想 ? 聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明 Taq DNA聚合酶的問世和應(yīng)用使 PCR可以高效率的進(jìn)行，隨后 PECetus公司推出了第一臺(tái) PCR自動(dòng)化熱循環(huán)儀，使 PCR技術(shù)得到了廣泛應(yīng)用 **1993年 ， Mullis等因該項(xiàng)技術(shù)分明獲 諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng) Kary B. Mullis（ 1944－） PCR技術(shù)問世背后的故事 ? 在一個(gè)春天的夜晚 ,Mullis與女友駕車于美國(guó)加州西岸的 128號(hào)公路途中有了 PCR的 靈感 ? Cetus公司以 1萬 $獎(jiǎng)勵(lì)他發(fā)展 PCR，其后卻于 1991年轉(zhuǎn)手將專利權(quán)以 3億 3千 5百萬 $轉(zhuǎn)賣給全球最大的制藥廠 瑞士 offmanLaRoche公司 ，而使得 PCR這個(gè)技術(shù)成為史上最貴的專利 ? 瑞士這家公司現(xiàn)在正以連鎖反應(yīng)般的速率賺進(jìn)美金 ? 此后， PCR的應(yīng)用一日千里，相關(guān)的論文發(fā)表量令其他研究難望其項(xiàng)背 ? PCR對(duì)于基礎(chǔ)及臨床醫(yī)學(xué)的貢獻(xiàn)之深遠(yuǎn)，也難以估量 ? 有時(shí)候一個(gè)創(chuàng)造性的靈感在你不經(jīng)意中突然浮現(xiàn)出來 ? 在 1983年 4月的一個(gè)星期五的晚上 ，我和一個(gè)化學(xué)家朋友正在驅(qū)車去 Mendocino縣的路上，她睡著了，美國(guó) 10l國(guó)道也沒有駕車要求了。由一條寡核苷酸引導(dǎo)靶 DNA一條鏈的合成，我可以獲得關(guān)于兩條鏈的互補(bǔ)序列的信息。然而，我感受最深的是山路的邊緣。我停下我的汽車在公路旁側(cè)，俯瞰安德森山谷。 ? 我確證 2的 20次冪確實(shí)超過了一百萬以上，并且可依此類推。我可以通過設(shè)計(jì)與序列兩端雜交的引物來獲得起始 DNA樣品的較大片段?！澳悴粫?huì)相信，”我大叫，“簡(jiǎn)直不可思議 !” ? 她拒絕起床。 ? PCR的發(fā)明是 DNA操作技術(shù)的革命 復(fù)習(xí) ? 五要素及其特點(diǎn) ? 反應(yīng)過程 ? 產(chǎn)物類型 ? 產(chǎn)物累積特點(diǎn) 謝 謝 靜夜四無鄰，荒居舊業(yè)貧。 05:56:5605:56:5605:56Friday, March 17, 2023 1乍見翻疑夢(mèng)，相悲各問年。 2023年 3月 17日星期五 5時(shí) 56分 56秒 05:56:5617 March 2023 1做前，能夠環(huán)視四周；做時(shí)，你只能或者最好沿著以腳為起點(diǎn)的射線向前。 :56:5605:56Mar2317Mar23 1世間成事，不求其絕對(duì)圓滿，留一份不足，可得無限完美。 2023年 3月 上午 5時(shí) 56分 :56March 17, 2023 1少年十五二十時(shí)，步行奪得胡馬騎。 05:56:5605:56:5605:563/17/2023 5:56:56 AM 1越是沒有本領(lǐng)的就越加自命不凡。 :56:5605:56:56March 17, 2023 1意志堅(jiān)強(qiáng)的人能把世界放在手中像泥塊一樣任意揉捏。 上午 5時(shí) 56分 56秒 上午 5時(shí) 56分 05:56: MOMODA POWERPOINT Lorem ipsum dolor sit, eleifend nulla ac, fringilla purus. Nulla iaculis tempor felis amet, consectetur adipiscing elit. Fusce id urna blanditut cursus. 感謝您的下載觀看 專家告訴