免疫印跡法的實驗技術(shù)-預(yù)覽頁
【正文】 是將 SDS 與蛋白質(zhì)充分結(jié)合，以使蛋白質(zhì)完全變性和解聚，并形成棒狀結(jié)構(gòu)同時使整個蛋白帶上負(fù)電荷 。 說明： ? 不是所有的蛋白質(zhì)都能用 SDS凝膠電泳法測定其分子量，已發(fā)現(xiàn)有些蛋白質(zhì)用這種方法測出的分子量是不可靠的。 ? 有許多蛋白質(zhì)，是由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（如 α胰凝乳蛋白酶）組成的，它們在 SDS和巰基乙醇的作用下，解離成亞基或單條肽鏈。 ?常用的固相支持物有 NC （硝酸纖維素）膜、尼龍膜及 PVDF（聚偏氟乙烯）膜。 ?不影響后續(xù)的顯色檢測（也就是適合用于所選顯色方法） ?轉(zhuǎn)膜 通常有兩種方法：毛細(xì)管印跡法和電泳印跡法。 實驗前的準(zhǔn)備 ?設(shè)備和材料的準(zhǔn)備 : 轉(zhuǎn)移電泳槽的準(zhǔn)備 (本實驗用垂直電泳槽 )、 轉(zhuǎn)移電泳儀的準(zhǔn)備、膜、濾紙、海綿墊、玻璃棒 ?試劑的準(zhǔn)備和配置 :電轉(zhuǎn)液、甲醇（ PVDF膜）、（考馬斯亮藍(lán)染色液、麗春紅染色液） ?根據(jù)待測樣品的蛋白質(zhì)分子量選擇轉(zhuǎn)移的電流大小及時間 .我們通常 200mA/膜，按照目的 蛋白分子大小、膠濃度 選擇轉(zhuǎn)移時間，具體可以根據(jù)實際適當(dāng)調(diào)整。 ?取膠：撬開玻璃板，將多余的膠切除，把裁好的膠放人轉(zhuǎn)移液中。 ?③小心取出轉(zhuǎn)移膜，做好標(biāo)記，在 1 TBST液中漂洗兩次。 ?必須保證 “三明治” 各層之間均無氣泡 。 五、固相免疫檢測 ?轉(zhuǎn)移結(jié)束后，借助抗原抗體反應(yīng)，利用ECL（增強化學(xué)發(fā)光）發(fā)光或 DAB（ 3,3二氨基聯(lián)苯胺）顯色技術(shù)檢測目的蛋白。 ? ECL結(jié)果 DAB結(jié)果 實驗前的準(zhǔn)備 : ? 洗膜用平皿 ? 搖床 ? ECL發(fā)光所需 (避光盒、 X光片、 X光片曝光盒等 ) : ? 封閉液 (5%脫脂奶粉、 BSA、 WesternBlot 膜封閉液） ? 一抗 ? 二抗 ? 抗體稀釋液 ? TBST緩沖液 ? ECL試劑盒或 DAB試劑盒 實驗步驟 ? 封閉：將轉(zhuǎn)移后的膜浸入封閉液中，室溫、搖床上緩慢搖動封閉1h（或 4℃ 過夜）；（封閉硝酸纖維素膜上剩余的疏水結(jié)合位點，使抗體只能跟特異的蛋白結(jié)合） ? ①將一抗用抗體稀釋液稀釋到所需濃度； ②將封閉后的膜放入一抗工作液中， 4℃ 反應(yīng)過夜 (或 37℃ ,2小 時 )。 ? TBST洗滌 10min3，室溫下緩慢搖動洗滌 ? （或 DAB顯色） 曝光及洗片方法 ?①按 1:1（ v/v）混合 ECL試劑盒中兩種液體。 ?④將曝光后 X光片放入顯影液中顯影、清水中漂洗、定影液中定影 1分鐘（具體曝光時間及顯影時間需根據(jù)顯影結(jié)果作出調(diào)整） 實驗注意事項 ，切勿使膜干掉 （否則導(dǎo)致背景增高） （濃度高不一定效果好，過高會導(dǎo)致背景變黑） 淬滅 時間來選擇合適的曝光時間。同時注意電泳槽裝置是否合適， 兩邊聚合不完全。轉(zhuǎn)膜過程注意降溫 ?背景太高 膜沒有均勻浸濕或出現(xiàn)干膜 膜或者緩沖液污染 封閉不充分 抗體與封閉劑出現(xiàn)交叉反應(yīng) 抗體濃度過高 原因 對 策 轉(zhuǎn)膜前用電轉(zhuǎn)液將膜完全浸濕，操作過程避免干膜 拿取膜與吸水紙時要戴手套，更換新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液 檢測一抗、二抗與封閉劑是否有交叉反應(yīng) 雜交前檢測一抗、二抗的工作濃度 LOGO Add your pany slogan
環(huán)評公示相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1