【正文】 usiyi兄出來(lái)給我解答！我也不知為什么BCA法測(cè)出來(lái)這么高，我用TCA法將上清沉淀后，跑電泳，后來(lái)見(jiàn)蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)上說(shuō)用TCA法沉淀上清能去除干擾物質(zhì)，我就測(cè)了下TCA沉淀后的蛋白濃度，經(jīng)過(guò)換算，是153mg/L。C凍存有兩年多了，最近拿出來(lái)做了感受態(tài)做轉(zhuǎn)化，用的是LiCl法，載體是pPIC9，按照推薦的量最后鋪板，生長(zhǎng)48h后RDB板上密密麻麻一層，設(shè)陰性對(duì)照同樣也長(zhǎng)了一層。sooow，你好！你說(shuō)的方法我看到了，正在嘗試，只是煮了煮，沒(méi)有液氮處理，擴(kuò)了兩次，可能是我挑菌后用無(wú)菌去離子水稀釋的濃度不對(duì)，或是其它原因，還沒(méi)有擴(kuò)增出來(lái)，我會(huì)繼續(xù)摸索條件的。謝謝你們依我看過(guò)的文獻(xiàn)和我們這邊表達(dá)的至少十幾個(gè)不同類型的蛋白來(lái)看高拷貝對(duì)應(yīng)高表達(dá)在99％的情況下是瞎扯，尤其對(duì)分泌表達(dá)的蛋白來(lái)說(shuō)決定蛋白分泌表達(dá)水平的一個(gè)重要因素是蛋白在胞內(nèi)正確折疊和信號(hào)肽分泌處理過(guò)程，很多蛋白表達(dá)量太低基本上都是由于這個(gè)問(wèn)題酵母對(duì)二硫鍵的加工能力有一定局限性，所以二硫鍵含量較多的蛋白，以及一些很大的蛋白表達(dá)不是很好我個(gè)人認(rèn)為MD板結(jié)合G418－YPD板篩選的主要作用是利用兩個(gè)標(biāo)記進(jìn)行“雙保險(xiǎn)”篩選，保證挑選的克隆基本是整合了目的基因的陽(yáng)性克隆，但是不代表重組蛋白一定會(huì)有表達(dá)影響蛋白分泌表達(dá)水平的因素有很多，如:蛋白本身性質(zhì)、基因劑量（拷貝數(shù)）、啟動(dòng)子類型、信號(hào)肽種類、細(xì)胞內(nèi)蛋白折疊能力、蛋白降解以及培養(yǎng)條件、誘導(dǎo)起始菌體濃度、誘導(dǎo)時(shí)間等等。提高到一定水平，細(xì)胞內(nèi)蛋白折疊能力又成為了限制因素。就單一強(qiáng)調(diào)某一因素而不結(jié)合具體表達(dá)目標(biāo)情況，那都是片面的。,沉淀兩很少,在有丙酮不預(yù)熱沉淀會(huì)很少,不過(guò)還是鹽沉淀.就是這樣了!Casamino acid 中文名叫什么呢？能加熱滅菌嗎?酸水解酪素，可以加熱滅菌。應(yīng)該是把MD板上的菌落全洗下來(lái)，稀釋到一定濃度，然后涂板。電轉(zhuǎn)化過(guò)程，生成了低拷貝的基礎(chǔ)上才能生成高拷貝。本人剛開(kāi)始作畢赤酵母表達(dá)，碰到了一個(gè)實(shí)質(zhì)性問(wèn)題，我的欲表達(dá)蛋白前端有一個(gè)信號(hào)肽，設(shè)計(jì)引物時(shí)沒(méi)有注意到這個(gè)問(wèn)題，現(xiàn)在就帶著信號(hào)肽直接連到載體上了，前面的工作都作完后，發(fā)現(xiàn)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)的上清液中檢測(cè)不到目的蛋白，不知是不是我引入的這段信號(hào)肽影響了目的蛋白的表達(dá)，請(qǐng)高手賜教！急！應(yīng)該不會(huì)，信號(hào)肽是被切割后，目的蛋白才分泌到培養(yǎng)基中的，也就是說(shuō)，只要酵母本身切割徹底，你的目的蛋白就能夠在培養(yǎng)基中得到。，可以試驗(yàn)25度，這樣蛋白酶的活性會(huì)受到抑制。2）把培養(yǎng)液轉(zhuǎn)到15ml離心管，4000RPM離心5分鐘，去上清。6）在蝸旋震蕩器上最大速度震蕩一分鐘。用1ml的移液槍把水相（上層）轉(zhuǎn)到一個(gè)干凈的Eppendorf管中。12) 13200RPM離心5 分鐘,去上清, 用70%的乙醇洗兩次，把DNA懸浮在500ul的TE中。15）13200RPM離心5 分鐘,去上清, 用70%的乙醇洗兩次，把DNA懸浮在200ul的TE中。1. 磷酸鉀溶液手冊(cè)說(shuō)要過(guò)慮,但能否高壓滅菌呢?2. 未轉(zhuǎn)化的酵母單克隆YPD培養(yǎng)液在搖了16h后,菌體像豆腐渣的,這樣正常嗎?1　磷酸鉀溶液高壓滅菌沒(méi)有問(wèn)題2　肯定不正常，是不是染菌了，涂片看看。一個(gè)基因的表達(dá)主要也就轉(zhuǎn)錄和翻譯兩步。先說(shuō)翻譯，密碼子的偏好性無(wú)疑是影響蛋白表大量的一個(gè)關(guān)鍵因素，基因二級(jí)結(jié)構(gòu)比如發(fā)卡結(jié)構(gòu)也應(yīng)當(dāng)是一個(gè)重要因素。今天最想和大家討論也是最想求助與大家的是：如果要通過(guò)Realtime PCR去分析一個(gè)外源基因的mRNA水平（哈哈，別笑我太奢侈）選擇一個(gè)什么樣的內(nèi)參合適，betaactin？GAPDH？酵母中是否也有這些看家基因。表達(dá)液徹底離心后,調(diào)節(jié)pH避開(kāi)中性范圍。134g用1L去離子水融解,就是10X的YNB了,不用加其它成分,過(guò)濾除菌就可以,不能高壓(我就是這樣做的,我們實(shí)驗(yàn)室就是買的這家公司的)G418我們這用的是上海生工的 SD6308, 40mg/mL的GS115的基因組DNA的提取方法分子克隆上講的很清楚,采用更簡(jiǎn)單的方法,就是反復(fù)煮凍煮,我就是這樣做,擴(kuò)不出來(lái)再煮凍,做了好幾輪PCR,最后出來(lái)了擴(kuò)增很亮,結(jié)果重復(fù)性也很好(當(dāng)然是用G418對(duì)HIS+轉(zhuǎn)化子進(jìn)行了高拷貝篩選之后的重點(diǎn)菌落做的,需要鑒定的菌落個(gè)數(shù)也不多,十有七八都是陽(yáng)性的,需要有耐心).我還沒(méi)開(kāi)始做，現(xiàn)在遇到一個(gè)問(wèn)題是，怎么能使信號(hào)肽被完全切掉，一個(gè)氨基酸殘基都不剩，因?yàn)椴恢朗Ｏ碌陌被釟埢鶗?huì)不會(huì)影響蛋白的活性，所以現(xiàn)在要先構(gòu)建一個(gè)質(zhì)粒，使其信號(hào)肽能100%被切掉。前導(dǎo)肽和間隔肽對(duì)蛋白質(zhì)的正確切割和分泌至關(guān)重要，但有時(shí)由于上述兩種基因產(chǎn)物的切割活力不同，會(huì)在外源蛋白的N端產(chǎn)生不同的切割位點(diǎn)，使一些分泌的蛋白N端帶有(Glu—Ala) 融合序列，即產(chǎn)生酵母信號(hào)肽切割不完全現(xiàn)象，也就是我在上面提到的問(wèn)題。我要做的蛋白N端對(duì)活性很重要，所以需要一個(gè)信號(hào)肽可以完全切掉的載體，目前正在查這方面的資料。不少人在操作中會(huì)遇到這樣那樣的問(wèn)題，生物通編者特地收集了部分用戶在使用EasySelect Pichia Expression System這個(gè)被譽(yù)為最簡(jiǎn)單的畢赤酵母表達(dá)的經(jīng)典試劑盒過(guò)程中的心得體會(huì)。=+，部分甲醇酵母更可以甲醇等工業(yè)產(chǎn)物替代葡萄糖作為碳源，生產(chǎn)成本低+++++ 表示優(yōu)勝于； 表示不如；= 表示差不多EasySelect Pichia Expression System產(chǎn)品性能：優(yōu)點(diǎn)——使用簡(jiǎn)單，表達(dá)量高，Histag便于純化缺點(diǎn)——酵母表達(dá)蛋白有時(shí)會(huì)出現(xiàn)蛋白切割問(wèn)題全面產(chǎn)品報(bào)告及心得體會(huì)：巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）是一種能高效表達(dá)重組蛋白的酵母品種，一方面由于其是屬于真核生物，因此表達(dá)出來(lái)的蛋白可以進(jìn)行糖基化修飾，另一方面畢赤酵母生長(zhǎng)速度快，可以將表達(dá)的蛋白分泌到培養(yǎng)基中，方便蛋白純化。在進(jìn)行克隆的時(shí)候，如果你選擇的是EcoRI，那么只需在目標(biāo)蛋白中增加兩個(gè)氨基酸序列即可完成。leslie：要做畢赤酵母表達(dá)實(shí)驗(yàn)，首先當(dāng)然就要了解這個(gè)可愛(ài)的酵母了（橢圓形，肥嘟嘟的，十分可愛(ài)），她和大腸桿菌長(zhǎng)得有較大區(qū)別（大腸桿菌是桿狀的），因此在培養(yǎng)的過(guò)程中要區(qū)別這兩種菌體，除了氣味，濃度，顏色以外，也可以取樣到顯微鏡中觀測(cè)。AOX1引物；⑨如果需要高量表達(dá)，可以考慮做克隆的時(shí)候串聯(lián)基因片段進(jìn)行表達(dá)，另外也可以在轉(zhuǎn)化酵母的時(shí)候重復(fù)轉(zhuǎn)化。XiangYang：EasySelect試劑盒準(zhǔn)備了三種菌株：X33，GS115和KM71H。一般來(lái)說(shuō)，如果是胞內(nèi)表達(dá)，應(yīng)盡量用Mut－細(xì)胞，這樣得到的蛋白產(chǎn)物中醇氧化酶蛋白量較少而目的蛋白量相對(duì)較多(約占Pp總分泌蛋白量的3090%，如人乙酰膽堿酯酶B變異鏈的含量占到90%，使下游純化更易進(jìn)行。在準(zhǔn)備酵母菌的同時(shí)也需要準(zhǔn)備質(zhì)粒，由于酵母菌轉(zhuǎn)化對(duì)轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的要求較高，量也較大（510ug），因此許多時(shí)候都會(huì)用PEG大提質(zhì)粒，或者用大提試劑盒，總而言之要準(zhǔn)備好足夠量的質(zhì)粒，并且不要忘記也要同時(shí)準(zhǔn)備空載體以做對(duì)照。沉淀回收之后是離心10分鐘，用80%的酒精洗滌后風(fēng)干，這一步需要多加注意保證風(fēng)干完全，因?yàn)橛袑?shí)驗(yàn)證明殘留的酒精對(duì)于轉(zhuǎn)化的影響頗大。（化學(xué)轉(zhuǎn)化）如果沒(méi)有電轉(zhuǎn)儀，LiCl轉(zhuǎn)化是一種可供選擇的方法，轉(zhuǎn)化率是102到103cfu/ug。第三步——挑克隆篩選XiangYang：在protocol中用了許多篇幅來(lái)指導(dǎo)這一步，包括如何去通過(guò)平板篩選，觀測(cè)生長(zhǎng)速率來(lái)確定Mut表現(xiàn)型等。其次是假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果，在Mut和Mut+情況是不一樣的，如果用的是539。掉了毛的鴕鳥(niǎo)：巴斯德畢赤酵母包含醇氧化酶1(AOX1)基因的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄終止子(5’AOX1和3’AOX1),他們被多克隆位點(diǎn)分開(kāi),外源基因可在此插入,此外，載體中還包含組氨酸脫氫酶基因(HIS4)選擇標(biāo)記（HIS4區(qū)的整合方式為位點(diǎn)特異性單交換引起的基因插入，整合后使組氨酸缺陷型宿主（his4），因而可利用表型差異進(jìn)行篩選，酵母GS115具有組氨醇脫氫酶缺陷型基因his4，可接受含HIS4的載體而具有HIS＋表型以篩選轉(zhuǎn)化子.）及3’AOX1區(qū),當(dāng)整合型載體轉(zhuǎn)化受體菌感受態(tài)細(xì)胞時(shí),他的5’AOX1和3’AOX1能與染色體上的同源基因重組,從而使整個(gè)載體和外源基因插入到受體菌染色體上，在加入甲醇作為唯一碳源的培養(yǎng)基中,外源基因在5’(抗G418)有助于篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子,轉(zhuǎn)化子的拷貝數(shù)與抗G418的能力有關(guān),因此不易丟失，多次傳代后酵母仍能穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白，具有良好的遺傳穩(wěn)定性.第四步——表達(dá)XiangYang：，就可以離心收菌。另外剛開(kāi)始的時(shí)候可以用小量表達(dá)，可以用5ml：生長(zhǎng)慢型，生長(zhǎng)快型，陰性對(duì)照（空質(zhì)粒），陽(yáng)性對(duì)照（可以是曾經(jīng)表達(dá)成功的重組子）和沒(méi)有進(jìn)行轉(zhuǎn)化的酵母菌的單克隆，BMGY中培養(yǎng)到OD值26，離心收菌（如果怕污染或者麻煩，可以放置酵母菌一段時(shí)間，一半為2030分鐘，讓菌沉淀下來(lái)，小心傾倒去上清培養(yǎng)基獲得菌），轉(zhuǎn)入BMMY中誘導(dǎo)表達(dá)，這些步驟都需要在超凈工作臺(tái)里進(jìn)行，如果要區(qū)分是否染菌，可以取一些到顯微鏡下觀察，或者聞氣味（酸甜的是酵母），觀顏色（乳白色的是酵母）。說(shuō)到紗布就想到了通氣性問(wèn)題，酵母在無(wú)氧和有氧的情況下都可以存活，但是在甲醇誘導(dǎo)的情況下畢赤酵母用的是醇氧化酶，自然氧氣量對(duì)于這一基因的表達(dá)影響重大，但是由于害怕感染大腸桿菌，紗布裹的也不能太少，最好專辟出一個(gè)搖床進(jìn)行三十度酵母表達(dá)，這樣可以考慮將紗布減少到3—5層，同時(shí)需要注意的是搖瓶?jī)?nèi)菌液體積不要超過(guò)1030%。所以需要進(jìn)行濃縮，方法有TCA法，硫酸氨鹽析，PEG沉淀，透析，超濾等等，當(dāng)然最簡(jiǎn)單的就是煮沸蒸發(fā)水分濃縮了。其它在表達(dá)中可能出現(xiàn)的情況包括表達(dá)量低，沒(méi)有分泌表達(dá)（針對(duì)pPICZa系列），頭兩天蛋白量較大，無(wú)法重復(fù)，表達(dá)出來(lái)的蛋白偏大等等，需要分各個(gè)方面分析原因，比如蛋白明明加上了信號(hào)肽，但是就是無(wú)法分泌出來(lái)，這可能是蛋白結(jié)構(gòu)在通過(guò)細(xì)胞膜的時(shí)候受到了阻礙，可能需要重新轉(zhuǎn)化，更換線性化位點(diǎn)或者更換菌株；如果蛋白表達(dá)第一天較高，但是之后越來(lái)越少，這很有可能是蛋白降解了或者產(chǎn)生了競(jìng)爭(zhēng)表達(dá)；畢赤酵母無(wú)法重復(fù)的問(wèn)題比較嚴(yán)重，許多情況下在第一次獲得了高量表達(dá)之后就再怎么也重復(fù)不了這個(gè)結(jié)果，遇到這種情況真是令人非常痛苦，可是除了重新摸索條件還能怎么樣呢？而表達(dá)出來(lái)的蛋白分子量偏大則是個(gè)正常現(xiàn)象，除了糖基化以外還有其它原因，比如二聚體，這些需要進(jìn)行WB或進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。伊可麗：由于在搖瓶培養(yǎng)中巴斯德畢赤酵母表達(dá)外源蛋白的水平往往不能準(zhǔn)確地反映罐發(fā)酵中的表達(dá)情況，使之成為令人頭痛的問(wèn)題。