【正文】 usiyi兄出來給我解答！我也不知為什么BCA法測出來這么高，我用TCA法將上清沉淀后，跑電泳，后來見蛋白質技術手冊上說用TCA法沉淀上清能去除干擾物質，我就測了下TCA沉淀后的蛋白濃度，經(jīng)過換算，是153mg/L。C凍存有兩年多了，最近拿出來做了感受態(tài)做轉化，用的是LiCl法，載體是pPIC9，按照推薦的量最后鋪板，生長48h后RDB板上密密麻麻一層，設陰性對照同樣也長了一層。sooow，你好！你說的方法我看到了，正在嘗試，只是煮了煮，沒有液氮處理，擴了兩次，可能是我挑菌后用無菌去離子水稀釋的濃度不對，或是其它原因，還沒有擴增出來，我會繼續(xù)摸索條件的。謝謝你們依我看過的文獻和我們這邊表達的至少十幾個不同類型的蛋白來看高拷貝對應高表達在99％的情況下是瞎扯，尤其對分泌表達的蛋白來說決定蛋白分泌表達水平的一個重要因素是蛋白在胞內正確折疊和信號肽分泌處理過程，很多蛋白表達量太低基本上都是由于這個問題酵母對二硫鍵的加工能力有一定局限性，所以二硫鍵含量較多的蛋白，以及一些很大的蛋白表達不是很好我個人認為MD板結合G418－YPD板篩選的主要作用是利用兩個標記進行“雙保險”篩選，保證挑選的克隆基本是整合了目的基因的陽性克隆，但是不代表重組蛋白一定會有表達影響蛋白分泌表達水平的因素有很多，如:蛋白本身性質、基因劑量（拷貝數(shù)）、啟動子類型、信號肽種類、細胞內蛋白折疊能力、蛋白降解以及培養(yǎng)條件、誘導起始菌體濃度、誘導時間等等。提高到一定水平，細胞內蛋白折疊能力又成為了限制因素。就單一強調某一因素而不結合具體表達目標情況，那都是片面的。,沉淀兩很少,在有丙酮不預熱沉淀會很少,不過還是鹽沉淀.就是這樣了!Casamino acid 中文名叫什么呢？能加熱滅菌嗎?酸水解酪素，可以加熱滅菌。應該是把MD板上的菌落全洗下來，稀釋到一定濃度，然后涂板。電轉化過程，生成了低拷貝的基礎上才能生成高拷貝。本人剛開始作畢赤酵母表達，碰到了一個實質性問題，我的欲表達蛋白前端有一個信號肽，設計引物時沒有注意到這個問題，現(xiàn)在就帶著信號肽直接連到載體上了，前面的工作都作完后，發(fā)現(xiàn)甲醇誘導表達的上清液中檢測不到目的蛋白，不知是不是我引入的這段信號肽影響了目的蛋白的表達，請高手賜教！急！應該不會，信號肽是被切割后，目的蛋白才分泌到培養(yǎng)基中的，也就是說，只要酵母本身切割徹底，你的目的蛋白就能夠在培養(yǎng)基中得到。，可以試驗25度，這樣蛋白酶的活性會受到抑制。2）把培養(yǎng)液轉到15ml離心管，4000RPM離心5分鐘，去上清。6）在蝸旋震蕩器上最大速度震蕩一分鐘。用1ml的移液槍把水相（上層）轉到一個干凈的Eppendorf管中。12) 13200RPM離心5 分鐘,去上清, 用70%的乙醇洗兩次，把DNA懸浮在500ul的TE中。15）13200RPM離心5 分鐘,去上清, 用70%的乙醇洗兩次，把DNA懸浮在200ul的TE中。1. 磷酸鉀溶液手冊說要過慮,但能否高壓滅菌呢?2. 未轉化的酵母單克隆YPD培養(yǎng)液在搖了16h后,菌體像豆腐渣的,這樣正常嗎?1　磷酸鉀溶液高壓滅菌沒有問題2　肯定不正常，是不是染菌了，涂片看看。一個基因的表達主要也就轉錄和翻譯兩步。先說翻譯，密碼子的偏好性無疑是影響蛋白表大量的一個關鍵因素，基因二級結構比如發(fā)卡結構也應當是一個重要因素。今天最想和大家討論也是最想求助與大家的是：如果要通過Realtime PCR去分析一個外源基因的mRNA水平（哈哈，別笑我太奢侈）選擇一個什么樣的內參合適，betaactin？GAPDH？酵母中是否也有這些看家基因。表達液徹底離心后,調節(jié)pH避開中性范圍。134g用1L去離子水融解,就是10X的YNB了,不用加其它成分,過濾除菌就可以,不能高壓(我就是這樣做的,我們實驗室就是買的這家公司的)G418我們這用的是上海生工的 SD6308, 40mg/mL的GS115的基因組DNA的提取方法分子克隆上講的很清楚,采用更簡單的方法,就是反復煮凍煮,我就是這樣做,擴不出來再煮凍,做了好幾輪PCR,最后出來了擴增很亮,結果重復性也很好(當然是用G418對HIS+轉化子進行了高拷貝篩選之后的重點菌落做的,需要鑒定的菌落個數(shù)也不多,十有七八都是陽性的,需要有耐心).我還沒開始做，現(xiàn)在遇到一個問題是，怎么能使信號肽被完全切掉，一個氨基酸殘基都不剩，因為不知道剩下的氨基酸殘基會不會影響蛋白的活性，所以現(xiàn)在要先構建一個質粒，使其信號肽能100%被切掉。前導肽和間隔肽對蛋白質的正確切割和分泌至關重要，但有時由于上述兩種基因產(chǎn)物的切割活力不同，會在外源蛋白的N端產(chǎn)生不同的切割位點，使一些分泌的蛋白N端帶有(Glu—Ala) 融合序列，即產(chǎn)生酵母信號肽切割不完全現(xiàn)象，也就是我在上面提到的問題。我要做的蛋白N端對活性很重要，所以需要一個信號肽可以完全切掉的載體，目前正在查這方面的資料。不少人在操作中會遇到這樣那樣的問題，生物通編者特地收集了部分用戶在使用EasySelect Pichia Expression System這個被譽為最簡單的畢赤酵母表達的經(jīng)典試劑盒過程中的心得體會。=+，部分甲醇酵母更可以甲醇等工業(yè)產(chǎn)物替代葡萄糖作為碳源，生產(chǎn)成本低+++++ 表示優(yōu)勝于； 表示不如；= 表示差不多EasySelect Pichia Expression System產(chǎn)品性能：優(yōu)點——使用簡單，表達量高，Histag便于純化缺點——酵母表達蛋白有時會出現(xiàn)蛋白切割問題全面產(chǎn)品報告及心得體會：巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）是一種能高效表達重組蛋白的酵母品種，一方面由于其是屬于真核生物，因此表達出來的蛋白可以進行糖基化修飾，另一方面畢赤酵母生長速度快，可以將表達的蛋白分泌到培養(yǎng)基中，方便蛋白純化。在進行克隆的時候，如果你選擇的是EcoRI，那么只需在目標蛋白中增加兩個氨基酸序列即可完成。leslie：要做畢赤酵母表達實驗，首先當然就要了解這個可愛的酵母了（橢圓形，肥嘟嘟的，十分可愛），她和大腸桿菌長得有較大區(qū)別（大腸桿菌是桿狀的），因此在培養(yǎng)的過程中要區(qū)別這兩種菌體，除了氣味，濃度，顏色以外，也可以取樣到顯微鏡中觀測。AOX1引物；⑨如果需要高量表達，可以考慮做克隆的時候串聯(lián)基因片段進行表達，另外也可以在轉化酵母的時候重復轉化。XiangYang：EasySelect試劑盒準備了三種菌株：X33，GS115和KM71H。一般來說，如果是胞內表達，應盡量用Mut－細胞，這樣得到的蛋白產(chǎn)物中醇氧化酶蛋白量較少而目的蛋白量相對較多(約占Pp總分泌蛋白量的3090%，如人乙酰膽堿酯酶B變異鏈的含量占到90%，使下游純化更易進行。在準備酵母菌的同時也需要準備質粒，由于酵母菌轉化對轉化質粒的要求較高，量也較大（510ug），因此許多時候都會用PEG大提質粒，或者用大提試劑盒，總而言之要準備好足夠量的質粒，并且不要忘記也要同時準備空載體以做對照。沉淀回收之后是離心10分鐘，用80%的酒精洗滌后風干，這一步需要多加注意保證風干完全，因為有實驗證明殘留的酒精對于轉化的影響頗大。（化學轉化）如果沒有電轉儀，LiCl轉化是一種可供選擇的方法，轉化率是102到103cfu/ug。第三步——挑克隆篩選XiangYang：在protocol中用了許多篇幅來指導這一步，包括如何去通過平板篩選，觀測生長速率來確定Mut表現(xiàn)型等。其次是假陽性和假陰性結果，在Mut和Mut+情況是不一樣的，如果用的是539。掉了毛的鴕鳥：巴斯德畢赤酵母包含醇氧化酶1(AOX1)基因的啟動子的轉錄終止子(5’AOX1和3’AOX1),他們被多克隆位點分開,外源基因可在此插入,此外，載體中還包含組氨酸脫氫酶基因(HIS4)選擇標記（HIS4區(qū)的整合方式為位點特異性單交換引起的基因插入，整合后使組氨酸缺陷型宿主（his4），因而可利用表型差異進行篩選，酵母GS115具有組氨醇脫氫酶缺陷型基因his4，可接受含HIS4的載體而具有HIS＋表型以篩選轉化子.）及3’AOX1區(qū),當整合型載體轉化受體菌感受態(tài)細胞時,他的5’AOX1和3’AOX1能與染色體上的同源基因重組,從而使整個載體和外源基因插入到受體菌染色體上，在加入甲醇作為唯一碳源的培養(yǎng)基中,外源基因在5’(抗G418)有助于篩選高拷貝轉化子,轉化子的拷貝數(shù)與抗G418的能力有關,因此不易丟失，多次傳代后酵母仍能穩(wěn)定表達外源蛋白，具有良好的遺傳穩(wěn)定性.第四步——表達XiangYang：，就可以離心收菌。另外剛開始的時候可以用小量表達，可以用5ml：生長慢型，生長快型，陰性對照（空質粒），陽性對照（可以是曾經(jīng)表達成功的重組子）和沒有進行轉化的酵母菌的單克隆，BMGY中培養(yǎng)到OD值26，離心收菌（如果怕污染或者麻煩，可以放置酵母菌一段時間，一半為2030分鐘，讓菌沉淀下來，小心傾倒去上清培養(yǎng)基獲得菌），轉入BMMY中誘導表達，這些步驟都需要在超凈工作臺里進行，如果要區(qū)分是否染菌，可以取一些到顯微鏡下觀察，或者聞氣味（酸甜的是酵母），觀顏色（乳白色的是酵母）。說到紗布就想到了通氣性問題，酵母在無氧和有氧的情況下都可以存活，但是在甲醇誘導的情況下畢赤酵母用的是醇氧化酶，自然氧氣量對于這一基因的表達影響重大，但是由于害怕感染大腸桿菌，紗布裹的也不能太少，最好專辟出一個搖床進行三十度酵母表達，這樣可以考慮將紗布減少到3—5層，同時需要注意的是搖瓶內菌液體積不要超過1030%。所以需要進行濃縮，方法有TCA法，硫酸氨鹽析，PEG沉淀，透析，超濾等等，當然最簡單的就是煮沸蒸發(fā)水分濃縮了。其它在表達中可能出現(xiàn)的情況包括表達量低，沒有分泌表達（針對pPICZa系列），頭兩天蛋白量較大，無法重復，表達出來的蛋白偏大等等，需要分各個方面分析原因，比如蛋白明明加上了信號肽，但是就是無法分泌出來，這可能是蛋白結構在通過細胞膜的時候受到了阻礙，可能需要重新轉化，更換線性化位點或者更換菌株；如果蛋白表達第一天較高，但是之后越來越少，這很有可能是蛋白降解了或者產(chǎn)生了競爭表達；畢赤酵母無法重復的問題比較嚴重，許多情況下在第一次獲得了高量表達之后就再怎么也重復不了這個結果，遇到這種情況真是令人非常痛苦，可是除了重新摸索條件還能怎么樣呢？而表達出來的蛋白分子量偏大則是個正?，F(xiàn)象，除了糖基化以外還有其它原因，比如二聚體，這些需要進行WB或進一步實驗驗證。伊可麗：由于在搖瓶培養(yǎng)中巴斯德畢赤酵母表達外源蛋白的水平往往不能準確地反映罐發(fā)酵中的表達情況，使之成為令人頭痛的問題。