新手上路westernblot問題集合-預(yù)覽頁
【正文】 濃度）(優(yōu)化的轉(zhuǎn)移緩沖液，可以參考《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊》)，因?yàn)榧状伎山档偷鞍踪|(zhì)洗脫效率，但可增加蛋白質(zhì)和NC膜的結(jié)合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對高分子量蛋白質(zhì)可延長轉(zhuǎn)移時(shí)間；%SDS，也是為了增加轉(zhuǎn)移效率；用優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)移膜，或使用小孔徑的NC膜（）；使用戊二醛交聯(lián)；低濃度膠，如低至6％。缺點(diǎn)是：溶劑系統(tǒng)的甲醇會(huì)引起硝化纖維素膜的皺縮或破壞，不能用于帶正電荷的膜。 Q8: 采用生物素標(biāo)記的二抗SABCDAB檢測系統(tǒng)做western，非特異性的條帶和背景很高，總蛋白考染的時(shí)候發(fā)現(xiàn)接近積層膠的條帶比較清楚，條帶也很窄，可是越靠下面的條帶越來越寬，有的跑得都連在一起，這是什么原因，如何解決？SDS—PAGE的時(shí)候恒壓和恒流哪個(gè)好？A8：非特異性的條帶和背景高：可能性很多，如一抗，二抗，封閉的原因都可能。同時(shí)洗的時(shí)候要徹底，而目的條帶弱，說明濃度不足，如果不考慮后續(xù)功能的話，可過G50（細(xì)）柱子，純化靶蛋白，接著真空冷凍濃縮，可以得到很好的結(jié)果。經(jīng)5%的脫脂牛奶封閉1小時(shí)45分鐘后，進(jìn)行一抗孵育（1：200，建議起始濃度）過夜，二抗孵育5個(gè)半小時(shí)（1:2000），均在室溫下，DAB顯色，雖出現(xiàn)蛋白條帶，但較弱，且出現(xiàn)非特異性條帶。
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