《限制性內(nèi)切酶》ppt課件-預(yù)覽頁
【正文】 現(xiàn)象，當(dāng)時稱作寄主控制的專一性（ host controlled specificity）。 104 的存活率是由宿主修飾系統(tǒng)作用的結(jié)果，此時限制系統(tǒng)還未起作用。 甲基胞嘧啶。 Ⅱ 型（ type Ⅱ ）限制與修飾系統(tǒng)所占的比例最大，達 93% 。識別序列主要為 46bp ，或更長且呈二重對稱的特殊序列，但有少數(shù)酶識別更長的序列或簡并序列，切割位置因酶而異，有些是隔開的。 在 Ⅱ 型限制酶中還有一類特殊的類型，該酶只切割雙鏈 DNA 中的一條鏈，造成一個切口，這類限制酶也稱切口酶 （ nicking enzyme），如 NBI 。EcoK 編碼基因的結(jié)構(gòu)為 R2M2S。 AA176。但這幾個核苷酸對則是任意的，如 EcoP1 和 EcoP15 。當(dāng)識別序列為 4 個和 6 個堿基時，它們可識別的序列在完全隨機的情況下，平均每 256 個和 4096 個堿基中會出現(xiàn)一個識別位點（ 4^4=256， 4^6=4096）。 EcoRⅠ 和 HindⅢ 的識別序列和切割位置如下： EcoRⅠ G↓AATTC； HindⅢ A↓AGCTT CTTAA↑G TTCGA↑A 有一些限制酶的識別序列不是對稱的，如 AccBSⅠ [CCGCTC（ 3/3） ] 和 BssSⅠ [CTCGTG（ 5/1） ]。 有一些限制酶識別的序列呈間斷對稱，對稱序列之間含有若干個任意堿基。切點在識別位點外側(cè)的還有 BbvⅠ [GCAGC（ 8/12） ] 和 BspMⅠ [ACCTGC（ 4/8） ] 等。 突出粘性末端，如 KpnⅠ 。當(dāng)識別序列為非對稱序列時，切割的 DNA 產(chǎn)物的末端是不同的，如 BbvCⅠ ，它的識別切割位點如下： CC↓TCAGC GGAGT↑CG 有些限制酶識別簡并序列，其識別的序列中有幾種是非對稱的。 ① 同序同切酶 這些酶識別序列和切割位置都相同，如 HindⅡ 與 HincⅡ 識別切割位點為 GTY↓RAC ， HpaⅡ 與 HapⅡ 識別切割位點為 C↓CGG ， MobⅠ 與 Sau3AⅠ 識別切割位點為 ↓GATC 。如 EcoRⅠ 識別和切割位點為 G↓AATTC ， ApoⅠ 識別和切割位點為 R↓AATTY ，后者可識別前者的序列。這些酶統(tǒng)稱為同尾酶。 ClaⅠ AT↓CGAT AccⅠ GT↓MKAC （ pUC19） 6．識別特殊系列的 Ⅰ prefix 和 pⅠ prefix 系列酶 有些線粒體、葉綠體、核 DNA 、 T 偶數(shù)噬菌體含有一些編碼內(nèi)切酶的內(nèi)含子，有些 intein （ protein splicing element） 也有內(nèi)切酶的活性，這兩類內(nèi)切核酸酶稱為 Ⅰ prefix 和 pⅠ prefix 系列內(nèi)切酶，它們識別的序列很長。 Ⅰ CeuI 酶是衣滴蟲（ Chlamydomonas eugametos）葉綠體大 rRNA 基因的內(nèi)含子編碼的產(chǎn)物，識別位點為 26bp ，識別的核心部位為 12 至 +7 位置的 19bp 。相對來說， EcoRⅠ 對兩端的序列長度要求較小，在識別序列外側(cè)有一個堿基對時在 2 小時的切割活性可達 90% 。另外，了解末端長度對切割的影響還可幫助在雙酶切多克隆位點時選擇酶切秩序。構(gòu)象的影響主要指切割線性 DNA 和超螺旋 DNA 時的活性，如與切割 λDNA 相比， EcoRⅠ 、 PstⅠ 、 SalⅠ 需要至少 倍的酶來切割 pBR322 的超螺旋 DNA
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