【正文】 年產(chǎn) 300 噸纖維素酶工廠的初步設(shè)計(jì) 中國(guó)礦業(yè)大學(xué) 2020 屆本科生畢業(yè)設(shè)計(jì) 第 2 頁 摘 要 纖維素是年產(chǎn)量巨大的可再生性資源，地球上每年光合作用生成的上億噸生物質(zhì)中，纖維素占了近一半。 本設(shè)計(jì)采用目前認(rèn)為是最好的產(chǎn)纖維素酶的菌種里氏木霉作為發(fā)酵菌種，液體深層發(fā)酵過程中采 用變溫發(fā)酵的方法分別控制菌種的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶，提取過程中采用超濾、層析等，提高產(chǎn)品的收率。 關(guān)鍵詞： 纖維素酶； 液體深層發(fā)酵； 里氏木霉 中國(guó)礦業(yè)大學(xué) 2020 屆本科生畢業(yè)設(shè)計(jì) 第 3 頁 ABSTRACT Cellulose is a kind of reproducible resource of great output, it takes about a half of the hundred million biomaterial making by photosynthesis. Presently, only a few cellulose are utilized, most of cellulose are wasted and pollute environment. It is of great importance to transfer these resource to energy ,food, and so on. This design adopt Trichoderma reesei which produce cellulase best. During the liquid submerged fermentation course we chang the temperature in order to control the growth that germ grows and produce cellulase respectively. Ultrafiltration and chromatography are used In the extrace process for improve the yield. In the end we make solid zymin by spray dring . The design mainly include the contents hereinafter: the layout of the whole factory ,the craft argumentation of the whole factory， the calculation of the craft， the calculation and type choosing of main equipments, the calculation of the costs. And design 8 charts , that are the layout of the whole factory, the design of the craft process(3), the design of the fermentation pot, the design of seeding tank, the lay out for equipments of the fermentation workplace(ichnography and space).According to the craft argumentation of the whole factory and the result of the calculation, the design can e up to the request of industrialization. Keywords: Cellulase。然而 ,目前約 80 %未被開發(fā)利用 ,具有極為誘人的前景。可是 ,當(dāng)前纖維素酶的高昂費(fèi)用是其難以在工業(yè)上被推廣應(yīng)用的主要因素。 纖維素酶 (cellulase)是利用產(chǎn)纖維素酶的菌株經(jīng)過固體發(fā)酵或液體深層發(fā)酵提取精制而成的液體狀酶制劑。纖維素酶對(duì)能源危機(jī)、食品和飼料緊張及環(huán)境污染等問題的解決有積極的作用 ,纖維素酶的開發(fā)利用將會(huì)產(chǎn)生很大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。如果能利用纖維素酶將大量的纖維素資源酶解成單糖，再經(jīng)發(fā)酵可生產(chǎn)出化工原料、飼料、燃料、食物和藥物等，開辟飼料、 發(fā)酵工業(yè)原料和人類食品的新來源，同時(shí)還可以處理廢物、減少公害、保護(hù)環(huán)境。纖維素酶的分泌又受分解代謝產(chǎn)物阻遏 (catabolite repression) 和反饋抑制 (feedback inhibition) 兩種作用。這方面的研究還甚少。連續(xù)培養(yǎng)的情況不同 ,保持較低 pH 時(shí) ,菌生長(zhǎng)受到抑制 ,酶產(chǎn)量減少 ,而保持 pH5. 0 時(shí)則可提高酶產(chǎn)量。 要獲得較高酶產(chǎn)量 ,發(fā)酵方法是非常重要的方面 ,目前生產(chǎn)纖維素酶的國(guó)家主要有日本、美國(guó)、德國(guó)和荷蘭。因不同真菌的纖維素酶系在各組分均衡性方面有互補(bǔ)的現(xiàn)象。隨后他的工作于 1913 年得到 Alexandrowicz 的證實(shí)。六十年代以后，由于分離技術(shù)的發(fā)展，推動(dòng)了纖維素酶的分離純化工作，對(duì)纖維素酶的組分、作用方式以及誘導(dǎo)作用等方面的研究進(jìn)展比較快 :并且實(shí)現(xiàn)了纖維素酶制劑的工業(yè)生產(chǎn) 。從此，纖維素酶也就正式加入了洗滌劑酶的行列 。然而由于纖維素酶蛋白結(jié)晶困難，現(xiàn)在關(guān)于纖維素酶分子結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究進(jìn)展仍比較緩慢。1970 年后中國(guó)科學(xué)院上海植物生 理研究所等單位利用誘變方法獲得了產(chǎn)酶能力較高的變異株，并進(jìn)行了生產(chǎn)試驗(yàn)。王成華等采用里氏木霉 A3，進(jìn)行紫外線和業(yè)硝基呱復(fù)合誘變后，得到了產(chǎn)纖維素酶活力較高的里氏木霉 91 一菌株 。尹清強(qiáng)等在黑白花奶牛日糧中添加纖維素酶 50g/頭‘天，產(chǎn)奶量提高%，飼料效率提高 %。從微紫青霉中克隆到的 CBHI 基因在體外無細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá) 。 20 世紀(jì) 80 年代中期上海就生產(chǎn)出纖維素酶。用纖維素酶進(jìn)行菜的軟化可避免上述缺點(diǎn)。椰子餅中含有很高的蛋白質(zhì)和脂肪，糖類含量也很高，但是卻不能作為糧食使用，因其纖維素含量較高，所以要用纖維素酶分解纖維素。在酶解過程伴有一系列的發(fā)酵過程，為醬油增加了特有的香氣和風(fēng)味。 纖維素酶在酒精發(fā)酵中的應(yīng)用 纖維素酶應(yīng)用于酒精生產(chǎn)提高原料出酒率的主要依據(jù)是：第一，薯干、玉米、高粱、木薯等淀粉質(zhì)原料中含有 1％ ～ 3％的纖維素和半纖維素，在纖維素酶的作用下轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵性糖，使原料中可利用的碳源增加，出酒率提高；第二，纖維素酶對(duì)纖維的降解作用，破壞間質(zhì)結(jié)構(gòu)壁的結(jié)構(gòu)，使其包含的淀粉釋放出來，利于糖化酶作用，從而可提高原料的淀粉利用率；第三，降低粉漿、蒸煮醪和糖化醪的粘 度 ，利于醪液的輸送和濃醪發(fā)酵的順利實(shí)施。目前存在的主要問題有：一是纖維素酶的活力較低，單位酶活力的生產(chǎn)成本較高，使得其在酒精廠中的應(yīng)用與推廣受到限制；二是酶活力的單位不統(tǒng)一，許多纖維素酶產(chǎn)品其標(biāo)明的活力單位達(dá) 1000030000u／ g，但“ u”的具體單位和測(cè)定酶活力的底物不詳，使其應(yīng)用缺乏依據(jù)；三是纖維素酶在酒精生產(chǎn)中應(yīng)用的工藝條件有待于進(jìn)一步研究。為了提高飼料的消化率，在配合飼料中添加極少量纖維素酶 (一般在 0． 1％ ～ 0． 3％ )即可收到顯著效果。在 飼料中添加纖維素酶后，喂幼雞、仔豬及一般虛弱動(dòng)物時(shí)，喂養(yǎng)效果明顯，喂蛋雞可提高 中國(guó)礦業(yè)大學(xué) 2020 屆本科生畢業(yè)設(shè)計(jì) 第 12 頁 產(chǎn)卵量，喂乳牛時(shí)，不僅可以使體重增加，而且提高產(chǎn)乳量。 纖維素酶還廣泛應(yīng)用于地質(zhì)鉆井中，其洗井用量為 0 l～ l kg／ m~孔段體積，它能在靜壓下使淤塞在井壁內(nèi)沖洗液中的魔芋聚糖催化水解為單糖，快速恢復(fù)巖層的透水性質(zhì)，提高洗并質(zhì)量。國(guó)內(nèi)生 產(chǎn)廠家少、生產(chǎn)規(guī)模小，應(yīng)用技術(shù)尚需進(jìn)一步攻關(guān)，產(chǎn)品供應(yīng)以進(jìn)口為主，供需矛盾較大。 纖維素酶的生產(chǎn) 纖維素酶的生產(chǎn)和其它酶制劑一樣，主要有固體發(fā)酵和液體深層發(fā)酵兩種，國(guó)內(nèi)外在這方面做了許多有價(jià)值的工作。趙小立等 (1996)采用銅蒸氣激光對(duì)黑曲霉誘變處理，篩選到纖維素酶高產(chǎn)菌株，用稻草鼓皮固體培養(yǎng)基， 28℃發(fā)酵 中國(guó)礦業(yè)大學(xué) 2020 屆本科生畢業(yè)設(shè)計(jì) 第 13 頁 培養(yǎng) 4d,每克濕曲的最高酶活 :CMC 酶活為 2839mg 葡萄糖 /}濾紙酶活為 299mg葡萄糖 1091 mg 葡萄糖 //。吳克等以綠色木霉為實(shí)驗(yàn)菌株，采用固體發(fā)酵法生產(chǎn)纖維素酶，發(fā)現(xiàn) CMC 酶和濾紙酶活在發(fā)酵過程中可以同時(shí)達(dá)到最大值，同時(shí)他們還建立了通過測(cè)定發(fā)酵曲中的麥角固醇含量來反映菌株生物量的方法 (吳克等， 2020 )。 GutierrezCornea 等 (1999)以經(jīng)堿處理的甘 蔗渣為主要碳源，研究了里氏木霉 LMUC4E I 和黑曲霉 ATCC10864 共同發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的條件。崔福綿 (1995)等從 生霉棉布上分離出康寧木霉，經(jīng)誘變處理獲得了高產(chǎn)纖維素酶的突變株CP88329，并研究了其固體發(fā)酵的條件。梁霆等 (1997)選育青霉菌 (Pemicillum sp.)用于纖維素酶液體深層發(fā)酵條件和生產(chǎn)工藝的研究，探討了纖維素酶一級(jí)和三級(jí)液體培養(yǎng)的條件。緩沖系統(tǒng)控制發(fā)酵液 pH, 28℃搖瓶發(fā)酵 6d，最高酶活達(dá)到 CMC 酶 100125U/mL， 中國(guó)礦業(yè)大學(xué) 2020 屆本科生畢業(yè)設(shè)計(jì) 第 14 頁 FPA912U/mL。譚宏等 (1996)在搖瓶試驗(yàn)的 基礎(chǔ)上，采用里氏木霉 HC415 菌株進(jìn)行了 SL 自控罐產(chǎn)纖維素酶深層發(fā)酵試驗(yàn)。 Romero 等(1999)以粗糙鏈抱霉 (Neurospora crassa)為菌種，將麥桿磨碎過篩作為主要碳源，研究了麥桿濃度、溫度和初始 pH 對(duì)葡聚糖內(nèi)切酶、葡聚糖外切酶和 223。有人采用里氏木霉作為發(fā)酵菌株，以經(jīng)過爆汽處理的柳木為主要碳源，分別研究了該菌在搖瓶、 4L和 22L 發(fā)酵罐中的產(chǎn)酶情況 (Reczey et al. , 1996 )。干冬等 (1996)以蟲熒光素酶法檢驗(yàn)了四株絲狀真菌在葡萄糖一無機(jī)鹽液體培養(yǎng)過程中的胞內(nèi) ATP 含量，結(jié)果表明 :只有當(dāng)胞內(nèi) ATP 濃度低于 10mg/mL 時(shí)，真菌才開始合成胞外纖維素酶 。 中國(guó)礦業(yè)大學(xué) 2020 屆本科生畢業(yè)設(shè)計(jì) 第 15 頁 固定化酶和細(xì)胞 除固體發(fā)酵和深層液體發(fā)酵外，有人還對(duì)纖維素酶的固定化進(jìn)行了研究。在間歇補(bǔ)料條件下，玉米桿原料的總量可提高， 7d 后還原糖濃 度 達(dá) g/L，糖化率為 %。當(dāng)以乳糖、纖維素和山梨糖為碳源時(shí)，氮源顯著影響這兩種酶活性。纖維素酶作為飼料添加劑，可使飼料的消化率從 50%60%提高到 80%以上，按我國(guó)年產(chǎn)飼料 5000 萬噸計(jì)，以 1‰的加入量，需求量有 5萬噸以上。此外，該酶制劑還被廣泛用于果汁加工、釀造等領(lǐng)域，市場(chǎng)潛力很大。 該公司主要生產(chǎn)液態(tài)纖維素酶。 上海三杰生物技術(shù)有限公司主要生產(chǎn)粉狀纖維素酶： 黃褐色冷凍干粉，酶活力 ≥15u/mg ， 15 元 /1 克 ； 黃褐色冷凍干粉，酶活力 ≥300u/mg ， 23 元 /克 。 由上面的 一些資料可以看出固態(tài)的酶比液態(tài)的酶要貴。 到目前為止，我國(guó)液體纖維素酶生產(chǎn)廠家較少，產(chǎn)量很小。 中國(guó)礦業(yè)大學(xué) 2020 屆本科生畢業(yè)設(shè)計(jì) 第 18 頁 2 全廠工藝流程及論證 工藝論證 無菌空氣制備系統(tǒng)工段工藝論證 無菌空氣系統(tǒng)工藝流程 空氣 粗過濾器 儲(chǔ) 氣 一級(jí)冷卻 空氣加熱 絲網(wǎng)分離 二級(jí)冷卻 旋風(fēng) 分離 空氣總過濾 空氣分過濾 纖維素酶為好氧發(fā)酵生產(chǎn)，需大量空氣。 發(fā)酵工業(yè)工廠所使用的空氣除菌流程隨各地的氣候條件不同而有很大差別。通常第一級(jí)冷卻到 30— 35℃，第二級(jí)冷卻到 20— 25℃除水后相對(duì)濕度仍為 100%，須再用加熱的方法將空氣的相對(duì)濕度降至 40%— 50%，再通過空氣過濾器過濾除菌。雖然離心式空氣壓縮機(jī)和渦輪式空壓機(jī)沒有易損的零部件，沒有潤(rùn)滑油的污染，但其比較適用于大 中國(guó)礦業(yè)大學(xué) 2020 屆本科生畢業(yè)設(shè)計(jì) 第 19 頁 型發(fā)酵工廠（投資大），由于本廠是中小型工廠設(shè)計(jì)，所以采用水冷式無油潤(rùn)滑的往復(fù)式壓縮機(jī)。 經(jīng)過一級(jí)冷卻，溫度降至 35℃，使大部分的水和油結(jié)成較大的霧粒 析出。經(jīng)第二次冷卻，分離后的空氣，油水去除得較為徹底。 10）過濾除菌： 介質(zhì)借助慣性碰撞，截留，沉降，凝聚等作用除去 微生物和較小的塵埃顆粒。里氏木霉要求的生長(zhǎng)環(huán)境粗放，適應(yīng)性較強(qiáng)，易于控制，便于管理； 3 里氏木霉產(chǎn)纖維素酶的穩(wěn)定性好。 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基 土豆 PDA 斜面 , 30 ℃培養(yǎng) 6 d 后使用。