20xx年醫(yī)學(xué)專(zhuān)題—流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人和小鼠細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子方法的建立-全文預(yù)覽
【正文】 CD4＋區(qū)的細(xì)胞來(lái)定義為T(mén)h細(xì)胞，這樣可以有效的避免單核細(xì)胞的干擾。國(guó)外有報(bào)道采用IFNγ、IL4和CD3進(jìn)行3色標(biāo)記[7]，這種方法只能觀察T淋巴細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞因子的變化，不能區(qū)分CD4＋和CD8＋細(xì)胞，筆者認(rèn)為是一種不可取的方法。一個(gè)檢測(cè)管同時(shí)染色，節(jié)約了抗體和勞動(dòng)量等檢測(cè)成本。雖然國(guó)內(nèi)部分學(xué)者認(rèn)為在PMA的刺激下，CD4仍可以維持一定的表達(dá)[3,4]，但是我們的結(jié)果和國(guó)內(nèi)部分[5]及國(guó)外的大多數(shù)[2,6]研究結(jié)果表明，在PMA的刺激下，CD4表達(dá)迅速下調(diào)，此時(shí)采用CD4來(lái)標(biāo)記Th細(xì)胞已經(jīng)不能準(zhǔn)確的檢測(cè)Th細(xì)胞，因而不能準(zhǔn)確的反應(yīng)Th1和Th2細(xì)胞的比率。雖然活化T淋巴細(xì)胞有各種各樣的方法，如：PMA、PHA、Con A、CDCD2和CD28等。4 正常Balb/c小鼠外周血Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞。典型的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。2 不同時(shí)間的PMA刺激對(duì)小鼠外周血T淋巴細(xì)胞抗原表達(dá)的影響。以前向角（FSC）和側(cè)向角（SSC）散射光散點(diǎn)圖設(shè)門(mén)區(qū)分淋巴細(xì)胞，以CD4直方圖設(shè)門(mén)區(qū)分Th細(xì)胞（CD4+），以IFNγ和IL4的散點(diǎn)圖表示Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞。g/ml 離子霉素刺激5h后，收集細(xì)胞。以前向角（FSC）和側(cè)向角（SSC）散射光散點(diǎn)圖設(shè)門(mén)區(qū)分淋巴細(xì)胞，以CD3和CD8散點(diǎn)圖設(shè)門(mén)區(qū)分Th細(xì)胞（CD3+CD8）。l洗滌兩次。l，4℃放置20min， 使細(xì)胞固定穿孔。分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，加入20ng/ml PMA和500ng/ml 離子霉素刺激4h后，收集細(xì)胞。g/ml， Golgistop。采用前向角（FSC）和側(cè)向角（SSC）散射光散點(diǎn)圖設(shè)門(mén)區(qū)分淋巴細(xì)胞，以直方圖分別表示CDCD8和CD4陽(yáng)性淋巴細(xì)胞。加入不同濃度的PMA（10ng、20ng和50ng終濃度）和500ng/ml Ionomycin共同刺激人外周血單個(gè)核細(xì)胞， Golgistop，37 ℃ CO2孵箱刺激4h。取出試管后，輕輕吸取液相交界的單個(gè)核細(xì)胞，加入Hanks液3ml，混勻后，1500g離心5min。實(shí)驗(yàn)方法1 外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離：取肝素抗凝正常人或者Balb/。抗小鼠CD4CYC、CD8PE。工作液：貯存液1:20 稀釋于RPMI 1640 培養(yǎng)基中，此時(shí)為50181。材料與方法試劑PMA（Sigma）貯存液：PMA 溶于DMSO ℃ 保存。由于流式細(xì)胞儀只能對(duì)細(xì)胞表面或內(nèi)部的抗原進(jìn)行檢測(cè)，因此必須阻止細(xì)胞因子的分泌。我們參照國(guó)內(nèi)外的一些文獻(xiàn)，對(duì)于人和小鼠Th1和Th2細(xì)胞的流式檢測(cè)方法進(jìn)行了探索，并比較了兩者之間的不同。目前已發(fā)現(xiàn)許多感染性疾病、自身免疫性疾病、過(guò)敏性疾病以及移植排斥反應(yīng)等都與Th1/Th2 平衡有關(guān)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人和小鼠Th細(xì)胞亞群早在1986年Mosmann等[1]依據(jù)小鼠分泌的細(xì)胞因子譜不同首次將Th細(xì)胞分為T(mén)h1和Th2兩個(gè)功能不同的獨(dú)立亞群。由于Th1/Th2 亞群及其相互之間的平衡在免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵的作用，Th1/Th2 平衡的失調(diào)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后有著密切的關(guān)系。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)因子是一種相對(duì)快速、重復(fù)性好并能準(zhǔn)確定量的方法。 淋巴細(xì)胞在刺激物的作用下活化，分泌細(xì)胞因子到細(xì)胞外。因此如何確定CD4+ T淋巴細(xì)胞非常重要，
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