20xx年醫(yī)學專題—流式細胞術檢測人和小鼠細胞內細胞因子方法的建立-全文預覽
【正文】 CD4＋區(qū)的細胞來定義為Th細胞，這樣可以有效的避免單核細胞的干擾。國外有報道采用IFNγ、IL4和CD3進行3色標記[7]，這種方法只能觀察T淋巴細胞表達的細胞因子的變化，不能區(qū)分CD4＋和CD8＋細胞，筆者認為是一種不可取的方法。一個檢測管同時染色，節(jié)約了抗體和勞動量等檢測成本。雖然國內部分學者認為在PMA的刺激下，CD4仍可以維持一定的表達[3,4]，但是我們的結果和國內部分[5]及國外的大多數(shù)[2,6]研究結果表明，在PMA的刺激下，CD4表達迅速下調，此時采用CD4來標記Th細胞已經不能準確的檢測Th細胞，因而不能準確的反應Th1和Th2細胞的比率。雖然活化T淋巴細胞有各種各樣的方法，如：PMA、PHA、Con A、CDCD2和CD28等。4 正常Balb/c小鼠外周血Th1細胞和Th2細胞。典型的檢測結果見圖2。2 不同時間的PMA刺激對小鼠外周血T淋巴細胞抗原表達的影響。以前向角（FSC）和側向角（SSC）散射光散點圖設門區(qū)分淋巴細胞，以CD4直方圖設門區(qū)分Th細胞（CD4+），以IFNγ和IL4的散點圖表示Th1細胞和Th2細胞。g/ml 離子霉素刺激5h后，收集細胞。以前向角（FSC）和側向角（SSC）散射光散點圖設門區(qū)分淋巴細胞，以CD3和CD8散點圖設門區(qū)分Th細胞（CD3+CD8）。l洗滌兩次。l，4℃放置20min， 使細胞固定穿孔。分離外周血單個核細胞，加入20ng/ml PMA和500ng/ml 離子霉素刺激4h后，收集細胞。g/ml， Golgistop。采用前向角（FSC）和側向角（SSC）散射光散點圖設門區(qū)分淋巴細胞，以直方圖分別表示CDCD8和CD4陽性淋巴細胞。加入不同濃度的PMA（10ng、20ng和50ng終濃度）和500ng/ml Ionomycin共同刺激人外周血單個核細胞， Golgistop，37 ℃ CO2孵箱刺激4h。取出試管后，輕輕吸取液相交界的單個核細胞，加入Hanks液3ml，混勻后，1500g離心5min。實驗方法1 外周血單個核細胞的分離：取肝素抗凝正常人或者Balb/?？剐∈驝D4CYC、CD8PE。工作液：貯存液1:20 稀釋于RPMI 1640 培養(yǎng)基中，此時為50181。材料與方法試劑PMA（Sigma）貯存液：PMA 溶于DMSO ℃ 保存。由于流式細胞儀只能對細胞表面或內部的抗原進行檢測，因此必須阻止細胞因子的分泌。我們參照國內外的一些文獻，對于人和小鼠Th1和Th2細胞的流式檢測方法進行了探索，并比較了兩者之間的不同。目前已發(fā)現(xiàn)許多感染性疾病、自身免疫性疾病、過敏性疾病以及移植排斥反應等都與Th1/Th2 平衡有關。流式細胞術檢測人和小鼠Th細胞亞群早在1986年Mosmann等[1]依據(jù)小鼠分泌的細胞因子譜不同首次將Th細胞分為Th1和Th2兩個功能不同的獨立亞群。由于Th1/Th2 亞群及其相互之間的平衡在免疫應答的調節(jié)中起著關鍵的作用，Th1/Th2 平衡的失調與多種疾病的發(fā)生發(fā)展和預后有著密切的關系。流式細胞術檢測細胞內因子是一種相對快速、重復性好并能準確定量的方法。 淋巴細胞在刺激物的作用下活化，分泌細胞因子到細胞外。因此如何確定CD4+ T淋巴細胞非常重要，
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