原核生物的基因表達(dá)與操作-全文預(yù)覽
【正文】 復(fù)性等。 （不是特別有效的程序） 2. 誘導(dǎo)大腸桿菌細(xì)胞的外膜發(fā)生有限的滲漏， 導(dǎo)致胞內(nèi)的蛋白質(zhì)向胞外培養(yǎng)基方向分泌。 缺點： 1. 包含體 ? a. 蛋白質(zhì)折疊了，再折疊的蛋白質(zhì)可能無法 恢復(fù)其生物學(xué)活性 ? b. 蛋白質(zhì)的終產(chǎn)量偏低 ? c. 蛋白質(zhì)的生產(chǎn)成本比較昂貴 2. 還原的環(huán)境不利于二硫鍵的形成 （硫氧還蛋白系統(tǒng)、谷氧還蛋白系統(tǒng)） ? ? ，因此純化比較復(fù)雜 周質(zhì)中表達(dá) ? 周質(zhì)：在大腸桿菌一類格蘭氏陰性菌 中，位于內(nèi)膜和外膜之間的細(xì)胞 結(jié)構(gòu)部分。 ? Xa切割法： 能唯一地從特異識別序列 C－末端切割多肽 增強(qiáng)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性 DNA整合入宿主染色體中 加強(qiáng)分泌 外源蛋白質(zhì)在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)部位 : ? 1. 細(xì)胞質(zhì)中表達(dá) ? 2. 周質(zhì)中表達(dá) ? 3. 胞外表達(dá) 細(xì)胞質(zhì)中表達(dá) : ? 外源基因在大腸桿菌寄主細(xì)胞質(zhì)中高效表達(dá)時，常會發(fā)生一種特殊的生理現(xiàn)象，形成包含體。 轉(zhuǎn)化原核細(xì)胞并誘導(dǎo)表達(dá) 裂解細(xì)胞，親和柱層析分離融合蛋白 切割融合蛋白獲得目的蛋白 主要步驟： 例：谷胱甘肽 S轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記物 融合蛋白質(zhì)的純化的基本原理： 利用與融合蛋白質(zhì)配偶體相對應(yīng)的配體作為吸附劑，制備親和層析柱，通過配偶體與配體之間的相互作用，過柱的融合蛋白質(zhì)被滯留下來，其它蛋白質(zhì)則流出柱外，經(jīng)洗脫處理，便可回收到純化的融合蛋白質(zhì)。 ? 缺點：在宿主細(xì)胞內(nèi)容易被蛋白酶降 解，蛋白產(chǎn)量低；分離純化費(fèi)時費(fèi)力， 成本較高。 所表達(dá)的蛋白質(zhì)以真核蛋白的 mRNA的 AUG為起始，在其氨基 端不含細(xì)菌多肽序列。 ? 含 tac啟動子的表達(dá)載體，如 pKK2233。在低溫 (2830℃)時， cIts857阻遏蛋白可阻遏 PL啟動子轉(zhuǎn)錄。 分離功能的啟動子 ? 將大腸桿菌基因組的酶切片斷 ， 克隆在 pOK1質(zhì)粒載體的單克隆位點上； ? 將 DNA重組分子 ， 轉(zhuǎn)化給宿主細(xì)胞 （ GalE＋ 、 GalT＋ 、 GalK－ ） ， 避免內(nèi)源半乳糖激酶的干擾； ? 將它們涂布在麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基 （ 含有 PH值指示劑的中性紅和結(jié)晶紫 ， 檢測碳水化合物 ） 上 ， 篩選轉(zhuǎn)化子 （ 重組子產(chǎn)生紅色的菌落 ） 。 ? 追蹤某種特定的 DNA結(jié)構(gòu) （ 重組質(zhì)粒 ）是否已經(jīng)導(dǎo)入寄主細(xì)胞 、 抑或是器官和組織；也可用來同任何一種目的啟動子連接 ， 因此其表達(dá)活性可作為檢測啟動子功能的依據(jù) 。 ? 3. 真核基因 mRNA的分子結(jié)構(gòu)同細(xì)菌的有所差異， 影響真核基因 mRNA穩(wěn)定性。3 原核生物的基因表達(dá)與操作 原核生物的基因表達(dá) 有功能的啟動子的分離 可調(diào)控
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