pcr技術(shù)及其應(yīng)用-全文預(yù)覽
【正文】 克隆（ＲＴ－ＰＣＲ） 逆轉(zhuǎn)錄酶 ＤＮＡ聚合酶 mRNA cDNA 雜交雙鏈 PCR擴(kuò)增 1. 細(xì)胞或組織固定：細(xì)胞經(jīng)固定和乙醇通透化處理后便適于一般 PCR試劑 （ 包括引物和 Taq酶 ） 進(jìn)入 2. PCR擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)目的片段 3. 原位雜交檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物 mRNA表達(dá) 原位ＰＣＲ分析基因表達(dá)的組織特異性 熒光定量 PCR（ realtime PCR)分析基因表達(dá)水平 通過(guò)熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針 ,對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤 ,實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程 ,結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析 ,計(jì)算待測(cè)樣品的初始模板量。 三、操作步驟 。 未知序列 未知序列 已知序列 已知序列 未知序列 未知序列 限制酶 限制酶 連接酶 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀 梯度 PCR儀 普通 PCR儀 材料：含 儀器：微量移液器及吸頭、 PCR儀及 PCR管 瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備 試劑： 10XPCR 反應(yīng)緩沖液 25mmol/L MgCl2 10mmol/L dNTP 10μ mol/L 引物 1和引物 2 二、實(shí)驗(yàn)材料、儀器和 試劑 （ 50181。 （ 6）引物 3’ 端為關(guān)鍵堿基； 5’ 端無(wú)嚴(yán)格限制。 （ 2）引物長(zhǎng)度以 1540 bp為宜。 2）循環(huán)參數(shù) (1)變性 使雙鏈 DNA解鏈為單鏈 94℃ ， 3060秒 (2) 退火 溫度由引物長(zhǎng)度和 GC含量決定。 （ 5） Mg2+ Mg2+是 DNA聚合酶的激活劑。 PCR反應(yīng)條件 （ 2）引物濃度 ?mol/L 濃度過(guò)高易導(dǎo)致模板與引物錯(cuò)配 ,反應(yīng)特異性下降。 PCR反應(yīng)循環(huán) 72℃ 94℃ 55℃ PCR循環(huán) 變性 退火 延伸 PCR的指數(shù)擴(kuò)增（ 2n） 引物 延伸 延伸 5’ 5’ 3’ 3’ 變性、退火 變性、退火 變性、退火 延伸 Taq P1 P2 PCR反應(yīng)體系 dATP dTTP dGTP dCTP
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