【正文】 ]。 ERCC1表達與卵巢上皮癌患者化療反應及生存期的關系鉑類藥物通過與DNA形成加合物(PtDNA adduct)而殺傷腫瘤細胞，NER系統(tǒng)中的關鍵酶ERCC1負責識別此加合物并將其切除，導致腫瘤對鉑類藥物耐藥[5, 6]。（2.）多樣性與復雜性變異剪接是從相對簡單的基因組提高蛋白質組多樣性的重要機制，蛋白質組的多樣性與多細胞高等生物的復雜性相適應。分述如下：（1）變異剪接是在RNA水平調控基因表達的機制之一。因此，選擇剪接可以造成不同的基因表達效應。兩個外顯子不能同時出現在同一個成熟的mRNA中，即互斥外顯子(mutually exclusive exon)。本次研究的ERCC1第8號外顯子就屬于此種情況，產生缺失ERCC1第8外顯子的機制是外顯子的跳躍。其原因在于蛋白質組、基因重排，RNA編輯，和變異剪接等機制可以從一個基因產生多種蛋白，從而使蛋白質組中蛋白質的數量超過基因組中基因的數量。并推測在高級真核細胞生物約5％的基因有可變剪接。Logrank test分析表明，ERCC1 mRNA表達量與患者的生存期相關(P=)，缺失第VIII外顯子變異剪接體的表達量與患者的生存期不存在相關性（P=），在總量中去除變異剪接體的量后，ERCC1全長mRNA的表達水平與生存期具有更低的P值。177。177。統(tǒng)計分析表明，缺失第VIII外顯子變異剪接體的表達量與卵巢癌化療反應性無關。納入卵巢癌患者的組織學分級Cell differentiation of the included ovarian cancer patients組織學的分級例數構成比%高度分化11%中度分化20%低度分化32%總計63100% TaqMan實時熒光定量RTPCR檢測mRNA使用構建好的TaqMan實時熒光定量RTPCR平臺檢測卵巢癌組織中的ERCC1基因總量mRNA，缺失第8外顯子的ERCC1變異剪接體的表達量，分析效率在95%～105%，～。Obst233。根據國際婦產科聯(lián)盟（F233。使用logrank test對數秩檢驗對生存期進行統(tǒng)計檢驗。TaqMan 實時熒光定量PCR程序設置Program for TaqMan Realtime quantitative PCR ( Draw by Jiang Sheng)每個標本均在三個反應體系中同時用三套引物進行擴增，每個標本重復三次。 TaqMan實時熒光定量PCR檢測mRNA表達水平首先將整個反應條件進行優(yōu)化，優(yōu)化后的分析效率在95%～105%，～。每個標本均在三個反應體系中同時用三套引物進行擴增，每個標本重復三次。3’)引物特征產物長度bpTERCC1ATACCCCTCGACGAGGATGAG第II外顯子末端77ACAGTGGGAAGGCTCTGTGTAGA第III外顯子始端FAM CGGAATAAGGGCTTGGCCACTCCATAMRA第II與III外顯子連接處ASERCC1CCAGCGGACCTCCTGATG第VII外顯子末端151和79*CTCTTGATGCGGCGATGAG第IX外顯子始端FAMAGGACTTCGTCTCCCGGTCTCTGGAACTAMRA第VII與IX外顯子連接處TaqMan betaactinGGCACCCAGCACAATGAA1898GGAAGGTGGACAGCGAGG18FAMCAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGCTAMRA25由于合成后的引物Olig Primer 和Probe呈膜狀附在管壁上，在使用前先瞬時離心，再輕輕打開管蓋。②呈現細胞周期依賴的表達。④表達水平與細胞周期以及細胞是否活化無關。選擇適當的內參基因以減少檢測標本間的差異是必須的。但在PCR擴增中，溶液中的模板變性后低溫退火時，引物與探針同時與模板結合。此外，由于一個 PCR 產物可以與多分子的染料結合，因此 SYBR Green I的靈敏度很高。 SYBR Green I的最大吸收波長約為 497nm ，發(fā)射波長最大約為 520nm 。前者由于增加了探針的識別步驟，特異性更高，但后者則簡便易行。CT 值與起始模板的關系研究表明，每個模板的 CT 值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多， CT 值越小。而在平臺期，擴增產物已不再呈指數級的增加，所以PCR 的終產物量與起始模板量之間沒有線性關系，根據最終的 PCR 產物量不能計算出起始 DNA 拷貝數。而實時熒光定量 PCR 則是通過對 PCR 擴增反應中每一個循環(huán)產物熒光信號的實時檢測從而實現對起始模板定量及定性的分析。 目前實時熒光 PCR 技術已經被廣泛應用于基礎科學研究、臨床診斷、疾病研究及藥物研發(fā)等領域。運用該項技術，可以對 DNA 、 RNA 樣品進行定量和定性分析。⑵質量檢測：，然后加入逆轉錄產物4181。③加逆轉錄酶MMuLV(200u/181。l10mMdNTP Mix 2181。：所有操作均在冰上進行。3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜熱微生物的熱穩(wěn)定性反轉錄酶：在Mn2+ 存在下，允許高溫反轉錄RNA，以消除RNA模板的二級結構。目前廣為使用的逆轉錄酶是四種，具體如下：1． Money 鼠白血病病毒（MMLV）反轉錄酶：有強的聚合酶活性，RNA酶H活性相對較弱。因此實驗前對隨機六聚體引物與總RNA的比例進行優(yōu)化是必要的。表明RNA提取的質量很好，可以用于本次研究。L總RNA溶液加1181。通過OD260值計算RNA總濃度：總RNA濃度(ug/181。：為了檢測所提取RNA的純度和質量，使用紫外分光光度計測量RNA溶液的吸光值，并使用瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶。加等體積異丙醇，搖勻，室溫放置10min，在4℃低溫13000rpm，離心15min，沉淀RNA。具體步驟如下：(1) 從液氮罐內取出保存的卵巢癌組織，并逐一核對住院號和姓名，剪取約200mg卵巢癌組織迅速置于液氮中，在液氮中使用研缽將卵巢癌組織研磨成粉末后加入Trizol 試劑1mL，充分混勻。已經有商品化的RNA提取試劑盒出售，如美國Invitrogen公司的TRIZol和日本Takara公司的RNAiso。人的皮膚是RNA酶污染的重要來源，用具處理過程中和試驗過程中均主意戴手套和帽子。冷卻至50℃左右，加入200μg/ml溴化乙錠(EB液)125μl混勻()。使用時取10mg/ml的貯存液200μl稀釋于10ml三蒸水中。所以物品均現配現用。%DEPC的水放置過夜，大概16小時后，吸取100ml，經高溫高壓30min后，即可除去DEPC，成為不含RNA酶的水。隨訪：生存時間的計算方法為從接受治療之初到隨訪結束或者死亡之時。M0無遠處轉移，M1遠處轉移（腹膜轉移除外）。Ⅲa 鏡檢證實盆腔外腹膜轉移超出盆腔外。 T2Ⅱa 腫瘤蔓延和/或轉移到子宮和/或輸卵管， T2a腹水或沖洗液中無惡性細胞。trique, FIGO）2000年修訂的臨床分期標準來判斷臨床期別：卵巢惡性腫瘤的手術病理分期FIGO TNM0 原發(fā)腫瘤無法評價 TX無原發(fā)腫瘤證據 T0Ⅰ 腫瘤局限于卵巢 T1Ⅰa 腫瘤局限于一側卵巢，包膜完整，表面無腫瘤， T1a腹水或腹腔沖洗液中未查見惡性細胞。d233。符合以上納入與排除標準者共計63例卵巢上皮癌患者納入研究。全部標本均經病理科醫(yī)師切片確診，病理科醫(yī)生并不知道病人納入與排除的情況，充分使用了盲法。切除修復交叉互補基因1(excision repair crossplementation group 1，ERCC1)是NER系統(tǒng)中的一個關鍵基因，其表達量與肺癌、胃癌、前列腺癌患者的預后相關。卵巢上皮癌組織中ERCC1基因mRNA表達水平與患者化療反應性和生存期的關系前言卵巢癌、宮頸癌和子宮內膜癌是婦產科最常見的三大惡性腫瘤，隨著宮頸癌和子宮內膜癌的早期診斷和治療已經取得了巨大的進步，卵巢癌已經成為嚴重威脅女性生命的惡性腫瘤，發(fā)現之時多已處于晚期，五年生存率一直在25%～30%徘徊[13]。研究表明，鉑類藥物的耐藥和核酸切除修復系統(tǒng)（nucleotide excision repair, NER）密切相關，NER系統(tǒng)可以修復鉑類化療藥所造成的DNA損傷，從而降低患者對化療的敏感性[49]。試驗流程1 材料與方法：我院自2000年1月至2006年12月所收治的原發(fā)性卵巢上皮癌患者，術前未接受化療，術后經病理確診。 排除標準：接受術前化療者；卵巢非上皮性癌者；病例資料不完整者；切除卵巢組織未行保存或者保存不善以致無法提取RNA者；拒絕將切除組織用于科研者。卵巢惡性腫瘤的病理分級、分期根據國際婦產科聯(lián)盟（F233。Obst233。Ⅱ 腫瘤累及一側或雙側卵巢，伴盆腔內轉移。 T2bⅢ 腫瘤侵犯一側或雙側卵巢，鏡檢證實盆腔外有腹膜轉移 T3和/或N1和/或區(qū)域淋巴結轉移。N0無區(qū)域