綿羊dgat1基因部分片段的遺傳多態(tài)性分析方法的建立畢業(yè)論文-全文預(yù)覽
【正文】 3mm，那么當(dāng)兩帶間距離在3mm以上，則說(shuō)明兩鏈之間有改變。它可以檢測(cè)各種點(diǎn)突變，短核苷酸序列的缺失或插入。該群體該位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性處于低度多態(tài)水平。在完成論文實(shí)驗(yàn)及寫(xiě)作過(guò)程中，我得到了很多老師的大力支持和同學(xué)們的熱心幫助，特別是臧榮鑫老師、董江陵老師及2007級(jí)研究生徐紅偉師兄，在此特意謝過(guò)這些老師和同學(xué)們。對(duì)該突變位點(diǎn)與部分生長(zhǎng)、胴體性狀的相關(guān)性分析表明,該基因位點(diǎn)與絨山羊育種指標(biāo)具有一定的相關(guān)性,其中BB基因型為有利基因型,這說(shuō)明若加強(qiáng)對(duì)BB基因型的選擇,提高B等位基因的比例,可望改善絨山羊的生長(zhǎng)發(fā)育及胴體性狀,并且其選擇潛力較大,可為今后蘭州大尾羊育種提供重要的基礎(chǔ)。本試驗(yàn)對(duì)DGAT1基因外顯子14的多態(tài)性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn):周歲綿羊群體在DGAT1基因外顯子14的第8位座位上存在1對(duì)等位基因A和B,其中A等位基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)等位基因。另外，SSCP分析中其它條件，如PCR產(chǎn)物的上樣量，PAG的交聯(lián)度、以及膠的濃度等，都應(yīng)根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)進(jìn)行選擇確定。檢測(cè)限是指突變DNA片段與正常DNA片段可分辨的電泳距離差的最小值。White曾設(shè)計(jì)了一組樣品DNA片段，并將其中的點(diǎn)突變?cè)O(shè)在DNA鏈的中部，而且該點(diǎn)又正處在發(fā)夾結(jié)構(gòu)頂端的環(huán)上，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SSCP只能檢測(cè)出9個(gè)樣品中的2個(gè)(檢出率為22%)，說(shuō)明DNA鏈中任何部位的突變，只要對(duì)其單鏈立體構(gòu)象沒(méi)有影響，都有可能被漏檢。這主要是由于開(kāi)始的高電壓可以使不同立體構(gòu)象的單鏈DNA初步分離，而凝膠的溫度不會(huì)升高。而有人認(rèn)為在DNA鏈較短的(400bp以下)情況下，DNA的長(zhǎng)度不會(huì)影響SSCP 的效果。這兩個(gè)條件保持不變，SSCP圖譜可保持良好的重復(fù)性。5)dNTP一般反應(yīng)中每種dNTP的終濃度為20~。兩電極間每厘米的電壓。（2）電泳中，這可給泳動(dòng)最快的DNA片段提供一個(gè)指征。:Tm =[（g + C）%]4 +[（a + T）%]2 （10）當(dāng)在引物5’端添加酶切位點(diǎn)時(shí)要考慮：①該目的序列內(nèi)部不得含有相同的酶切位點(diǎn)， ②如果PCR 后直接酶切，不要忘了在酶切位點(diǎn)的外側(cè)再加上保護(hù)堿基，不同的酶對(duì)于保護(hù)堿基的要求是不同的，如果不設(shè)計(jì)保護(hù)堿基，則多半要用TA克隆的方式連接到質(zhì)粒上，這時(shí)要注意Taq 酶的選擇 若想在目的序列上附加上并不存在的序列，如限制位點(diǎn)和啟動(dòng)子序列，可以加入到引物539。（9）引物的一個(gè)重要參數(shù)是熔解溫度（Tm）。引物的3’端的ΔG值過(guò)高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。（5）引物所對(duì)應(yīng)模板位置序列的Tm值在72℃左右可使復(fù)性條件最佳。另外，引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗。（2）引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒(méi)有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)配。→→ 溶于適量TE()(20~50ul)，加入10mg/ml RNase，使終濃度為20ug/ml，37℃水浴2h?！?每EP管加入2體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇和1/10體積的3M NaOAC(使其終濃度為3M)，20℃沉淀2h或過(guò)夜?！?重復(fù)步驟6，7?！?、 加入20%SDS，%；加入蛋白酶K，使終濃度為100ug/ml，輕柔混勻?！?超凈臺(tái)內(nèi)將10ml菌液轉(zhuǎn)移至50ml圓底離心管?？煞譃閺呐囵B(yǎng)細(xì)胞中提取DNA,從特定組織的人體細(xì)胞中提取DNA,和血液樣品的DNA提取等幾個(gè)類型。在第四個(gè)和第十二個(gè)樣品孔出現(xiàn)了一條突變的單鏈，表明基因存在多態(tài)性。電泳結(jié)束后→取下玻璃板,小心的將上面的玻璃板取下→然后浸入蒸餾水中2分→棄去蒸餾水→10%乙醇固定10分→浸入蒸餾水中2分→棄去蒸餾水→1% HNO3 氧化15分→浸入蒸餾水中2分→棄去蒸餾水→% AgNO3溶液→浸入蒸餾水中2分→棄去蒸餾水→3% Na2CO3溶液顯色紙條帶清晰為止→浸入蒸餾水中2分→棄去蒸餾水→10%乙酸終止染色→保存于10%乙酸中→并拍照,做結(jié)果分析用試劑盒法提取的羊基因組DNA,在1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè),條帶清晰,DNA可以用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)。（3）% AgNO3溶液 AgNO3 用蒸餾水定容至200ml。 loading Buffer，再加入2μLPCR產(chǎn)物，3000r/min離心30s后,在PCR儀上95℃變性5min,冰浴1215min,以維持DNA的單鏈狀態(tài)。（4）立即用電泳緩沖液沖洗加樣孔，沖走多余的未聚合的凝膠。2H2O,(H3BO3),混合加入1L的燒杯內(nèi),并加入800ml的去離子水,充分?jǐn)嚢柚镣耆芙?再加水定容至1L,室溫存放。（2）30%丙烯酰胺貯存液：稱取29g丙烯酰胺和1g甲叉雙丙烯酰胺溶于60ml上述的水中（必要時(shí)加熱至37℃），再定容至100ml，存放于4℃，備用。結(jié)束后，于凝膠成像系統(tǒng)上觀察條帶，特異性很好的PCR產(chǎn)物方可用于PCRSSCP檢測(cè)，無(wú)條帶或是非特異性條帶產(chǎn)物出現(xiàn)的產(chǎn)物都不能用于PCRSSCP。（11）8000g/min離心1min以從柱子上洗脫出DNA,收集管中的液體即為DNA溶解液。（7）把柱子裝到新的收集管中,吸取720μL用乙醇稀釋過(guò)的DNA洗滌液于柱中，8000g/min離心1min,棄去收集管。（4）在上清液中加入220μLZZII緩沖液,旋渦混合儀上混合均勻,70℃水浴10min。（3）其他試劑：瓊脂糖、鵬程生物 批號(hào)：Ameresco 0425600bp ladder Maker、上海生工生物工程有限公司 批號(hào)：HF4056loading buffer鵬程生物 批號(hào)：Ameresco 0463 、Tris堿 鵬程生物 批號(hào)：Ameresco 049過(guò)硫酸銨 萊陽(yáng)市雙雙化工有限公司 批號(hào)：、丙烯酰胺、西安化學(xué)試劑廠 批號(hào)：GBG7552去離子甲酰胺 批號(hào)：FDB 0212500ml、硝酸銀 西安化學(xué)試劑廠 批號(hào)：GBG707無(wú)水碳酸鈉 天津正太龍化工有限公司 批號(hào)：0704無(wú)水乙醇 煙臺(tái)雙雙化工有限公司 批號(hào)：、TE緩沖液 上海生工生物工程有限公司 批號(hào)：SD10甲醛 上海中秦化學(xué)試劑有限公司 批號(hào)：硼酸 天津巴斯夫化工有限公司 批號(hào)：本實(shí)驗(yàn)總體思路：采樣→進(jìn)行DNA提取→對(duì)提取的DNA進(jìn)行PCR→瓊脂糖電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性→PAGE檢測(cè)樣品基因的多態(tài)性本實(shí)驗(yàn)采用DNA提取試劑盒來(lái)提取基因組DNA，操作步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。本試驗(yàn)所用的樣品為綿羊的全血，樣本數(shù)量為4份，采取頸靜脈采血，用肝素鈉抗凝后，采樣后立即編號(hào)，迅速做DNA的提取。目前
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