【正文】 C,Malcovati techniques for human keratinocytes. 。34(1):39.[20] Nelson WG,Sun 50and 58kdalton keratin classes as molecular markers for stratified squamous epithelia: cell culture Cell 。54:14991505.[15] Techatanawat I collagen extracted from rattail and bovine Achilles tendon for dental application: a parative 。 21(4):481494.[12] Lane antibodies provide specific intramolecular markers for the study of epithelial tonofilament Cell 。 J,Kab225。a Belmonte and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem Protoc. 2010。76(3):12741278.[4] Lee V,Singh G,Trasatti JP,et and fabrication of human skin by threedimensional Eng Part C 。文章版權：文章出版前雜志已與全體作者授權人簽署了版權相關協(xié)議。文章查重：文章出版前已經(jīng)過CNKI反剽竊文獻檢測系統(tǒng)進行3次查重。結(jié)論：用絲裂霉素C處理的原代成纖維細胞作為飼養(yǎng)層比NIH3T3飼養(yǎng)層更有利于角質(zhì)細胞的生長，而且飼養(yǎng)層的接種細胞濃度為1108 L1時，原代角質(zhì)細胞的生長及克隆效率最優(yōu)，且比無血清條件下的原代角質(zhì)細胞生長快，成本低；實驗分別采用牛尾Ⅰ型膠原和鼠尾Ⅰ型膠原構(gòu)建3D人工皮膚，發(fā)現(xiàn)牛尾膠原構(gòu)建的皮膚收縮性更小，皮膚組織形態(tài)疏水性均和人體皮膚接近，從而可獲得更好的皮膚，降低皮膚生產(chǎn)的成本。天狼猩紅染料與膠原分子結(jié)合，長軸平行，可在偏振纖維鏡下加強雙折射，且與不同類型膠原結(jié)合，顏色會不一，可特異性的表征膠原類型，定位膠原及膠原粗細，被廣泛用于組織中膠原形態(tài)觀察及組織纖維化、組織病變形態(tài)觀察[17，41]，天狼猩紅染色比馬松三色染色效果更好。實驗發(fā)現(xiàn)與鼠尾膠原相比，牛尾膠原收縮會明顯降低，角質(zhì)細胞分別接種在這2種真皮層，牛尾膠原、成纖維細胞、角質(zhì)細胞構(gòu)建的皮膚更大，可更好解決皮膚移植時皮膚量不足的問題，牛尾膠原構(gòu)建的皮膚收縮性比鼠尾膠原小，猜測這與膠原性質(zhì)有關，如膠原纖維粗細、膠原凝膠支架的孔隙。Ⅰ型膠原是一種天然的生物可降解材料，雖然膠原的理化性質(zhì)較差，存在力學強度低、易收縮、易降解等缺點[30]，但具有良好的生物學性能，被廣泛用于組織工程支架、基質(zhì)材料[31]，已在臨床多個領域得到應用，如可吸收縫合線、人工皮膚。另外有研究比較不同飼養(yǎng)層接種密度的角質(zhì)克隆情況，結(jié)果證明了角質(zhì)細胞與飼養(yǎng)層1∶1接種，角質(zhì)細胞生長速度與克隆大小最理想[9]。實驗分別用胰酶和中性蛋白酶消化皮膚塊，結(jié)果發(fā)現(xiàn)中性蛋白酶處理過的皮膚表皮與真皮很容易分開，比胰酶處理的效果好(數(shù)據(jù)未在結(jié)果中顯示)。 3D人工皮膚組織的免疫熒光染色觀察 將牛尾膠原構(gòu)建人工皮膚組織進行角蛋白CK1CKⅣ型膠原免疫熒光學染色，其中CK14可表征皮膚的基質(zhì)層，CK1可顯示上面的肉芽層和角化層，Ⅳ型膠原可現(xiàn)實真皮層與表皮層的連接部位基層，見圖6。 3D人工皮膚的組織形態(tài)學觀察蘇木精伊紅染色結(jié)果：可見完整的真皮層與完整的表皮層，在牛尾膠原基質(zhì)上的角質(zhì)細胞長成更多層，可見角質(zhì)細胞在牛尾膠原基質(zhì)上生長更好，見圖4。成人皮膚樣品(浙江大學兒童附屬醫(yī)院提供)手指176。圖2 角質(zhì)細胞的免疫熒光鑒定結(jié)果(100)Figure 2 Identification of keratinocytes (immunofluorescence staining, x100)圖注：圖中A顯示，細胞含有角質(zhì)特異性角蛋白K14角蛋白；B顯示，細胞含有角質(zhì)特異性角蛋白P63角蛋白(100)。2 結(jié)果 Results 成纖維細胞和角質(zhì)細胞的分離 新鮮分離的原代成纖維細胞貼壁后6 d之內(nèi)可以長融合，呈明顯的旋渦狀纖維細胞樣生長，見圖1A；角質(zhì)細胞需要914 d才能長至融合，形態(tài)呈鋪路石狀，見圖1B。表1 兩種膠原層的各成分Table 1 Components of the two kinds of collagens成分非細胞膠原層(每孔1 mL)細胞膠原基質(zhì)層(每孔3 mL)10DMEM mL mL谷氨酰胺 mL mLFBS mL mL5 mol/L NaOH mL mL3 g/mL膠原 mL14 mL人原代成纖維細胞1 mL(細胞濃度2109 L1)總體積6 mL18 mL 主要觀察指標蘇木精伊紅染色：氣提培養(yǎng)完成，取出皮膚，40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS清洗1遍，經(jīng)體積分數(shù)50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、100%、100%乙醇脫水，體積分數(shù)50%乙醇二甲苯、純二甲苯、純二甲苯透明、過夜浸泡在石蠟中，第2天石蠟包埋，切 8 μm薄片，蘇木精伊紅染色，用干性樹膠封固，顯微鏡下觀察皮膚形態(tài)。首先構(gòu)建真皮層，在每個淺孔transwell孔先鋪一層非細胞膠原層，待成纖維細胞融合后胰酶消化，以終濃度2109 L1加至膠原溶液中，按表1順序依次加，將混合物在冰上混合均勻，取3 mL加至淺孔transwell中的內(nèi)孔，培養(yǎng)箱孵育30 min；膠原凝固后，將2 mL培養(yǎng)基加至淺孔transwell中的內(nèi)孔，3 mL加至外面的孔，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d左右，膠原和細胞一起收縮成穩(wěn)定大小的真皮層，第8天，成纖維細胞膠原層收縮完全，角質(zhì)細胞加至真皮層的中央，加50 181。飼養(yǎng)層的準備：待人皮膚成纖維細胞融合，用含10 mg/L絲裂霉素C的培養(yǎng)基在37 ℃培養(yǎng)2 h，消化重新接種至50%融合，飼養(yǎng)層貼壁后半融合對角質(zhì)細胞的克隆生長最優(yōu)[9]。3D人工皮膚體外構(gòu)建實驗的主要試劑：試劑來源Dispase中性蛋白酶RocheⅣ型膠原酶、DMEM粉末、F12粉末、霍亂毒素、三碘甲狀腺原氨酸、胰島素、乙醇胺、磷酸乙醇胺、轉(zhuǎn)鐵蛋白Sigma無鈣DMEM粉末上?？ㄟ~舒生物科技公司氫化可的松、腺嘌呤、胰蛋白酶、孕酮上海生物工程有限公司胎牛血清gibco人表皮生長因子peprotech絲裂霉素CmerckCKCollagen Ⅳ武漢博士德生物科技公司CK1P6IgGFITC Invitrogen 實驗方法 人包皮成纖維細胞及角質(zhì)細胞的分離：將新鮮的環(huán)切包皮放置在PBS中，在超凈工作臺去除皮下脂肪，經(jīng)含500 U/mL青鏈霉素雙抗的PBS漂洗3次，去除殘余的血液與脂肪，以眼科剪將皮膚塊剪成5 mm2大小的皮片， U/mL中性蛋白酶的HBSS中4 ℃過夜，消化18 h；次日用鑷子揭去表皮層，將表皮層放置在含有少許PBS的培養(yǎng)皿中，用于分離角質(zhì)細胞，剩下的真皮組織用PBS清洗2次，洗去殘余的角質(zhì)細胞，真皮層用于分離成纖維細胞，方法參考文獻[7]。此人工皮膚不僅可用于燒傷患者的皮膚移植，還可以作為新藥評價體外模型，充實了人工皮膚的構(gòu)建新方法。最初用飼養(yǎng)層來構(gòu)建二維共培養(yǎng)模型，缺點是形成的皮膚壽命短，不能形成幾層有序的角質(zhì)層細胞[23]。 Collagen。結(jié)果與結(jié)論：①鼠尾膠原構(gòu)建人工皮膚真皮層面積下降了50%，牛尾膠原構(gòu)建人工皮膚真皮層面積只下降了21%；②牛尾膠原構(gòu)建人工皮膚的接觸角與人皮膚接近，比鼠尾膠原構(gòu)建人工皮膚的疏水性更好；③天狼猩紅染色結(jié)果顯示，與鼠尾膠原構(gòu)建的人工皮膚相比，牛尾膠原構(gòu)建人工皮膚的膠原折光性更強，膠原排列更有序，纖維更粗；④蘇木精伊紅染色顯示，與鼠尾膠原構(gòu)建人工皮膚相比，