【正文】 號(hào)高速臺(tái)式低溫離心機(jī)德國 Eppendorf濕度CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱美國 BINDER熒光顯微鏡日本NikonE6006孔板北京耀北生物技術(shù)公司自動(dòng)數(shù)字天平ADEK120A全自動(dòng)高壓消毒鍋日本YamatoSM512方法 培養(yǎng)基的制備按照88%培養(yǎng)液，10%胎牛血清，1 %青霉素/鏈霉素，1%非必需氨基酸的量進(jìn)行混合， μm 濾膜過濾后于4 ℃保存。本設(shè)計(jì)把這兩種物質(zhì)聯(lián)合來進(jìn)行ips細(xì)胞誘導(dǎo)，尚屬首例，填補(bǔ)了無人著重研究使用小分子化合物進(jìn)行ips細(xì)胞誘導(dǎo)的空白。在iPS細(xì)胞的應(yīng)用取得了令人矚目的成就時(shí)，橫跨在科學(xué)界的一大障礙卻始終沒有被排除，它就是ips細(xì)胞的誘導(dǎo)率問題。它由體細(xì)胞導(dǎo)入外源轉(zhuǎn)錄因子重編程誘導(dǎo)而來，與ES細(xì)胞在功能、形態(tài)上基本一致。本課程設(shè)計(jì)從ips細(xì)胞比ES細(xì)胞甲基化程度高著手，研究提高ips細(xì)胞誘導(dǎo)率的方法。iPS細(xì)胞可能成為人類各種疾病細(xì)胞移植的一個(gè)資源，為人類疾病治療帶來了新的希望和契機(jī)，其研究的最終目的是應(yīng)用于臨床進(jìn)行自體細(xì)胞治療，現(xiàn)在很多人都非常期待iPS細(xì)胞能盡早應(yīng)用于多種疾病的臨床治療，如1型糖尿病、帕金森綜合征、脊髓損傷及慢性肝病等。3總結(jié)——本設(shè)計(jì)研究的價(jià)值隨著社會(huì)的發(fā)展，人們生活水平的的不斷提高，人們對(duì)健康的重視程度越來越深入然而，面對(duì)許多疾病，科學(xué)家們也束手無策。其抗腫瘤作用與其他嘧啶類拮抗劑不同，與嘧啶核苷酸代謝并無關(guān)系，而是以偽代謝物身份替代胞嘧啶摻入DNA及RNA，干擾DNA、RNA的生理功能而產(chǎn)生細(xì)胞毒作用及抗腫瘤作用。性狀：無色液體、極微溶于水、相對(duì)密度(d25)、沸點(diǎn)221℃、128～130℃()、折光率 ()；低毒，半數(shù)致死量(大鼠，經(jīng)口)670mg/kg；有腐蝕性。我們可以通過在轉(zhuǎn)化過程中抑制體細(xì)胞的甲基化來提高的ips細(xì)胞的誘導(dǎo)效率。而Kim 等則采用穩(wěn)定表達(dá)四因子融合蛋白的HK293細(xì)胞的裂解產(chǎn)物誘導(dǎo)人成纖維細(xì)胞，可最初連續(xù)6 d 的誘導(dǎo)處理卻引起受體細(xì)胞的死亡；隨后通過16 h 的蛋白誘導(dǎo)處理與新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)6 d 相結(jié)合，進(jìn)行反復(fù)6 輪誘導(dǎo)之后才最終得到了iPS 克隆。而且阻斷P53基因路徑的方法復(fù)雜?？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)，通過阻斷一個(gè)名為“p53”的基因的路徑，可以將皮膚細(xì)胞轉(zhuǎn)化為iPS細(xì)胞的成功率提高至10％左右，是原有轉(zhuǎn)化率的大約百倍。盡管在ips細(xì)胞方面取得了如此大的成就，但是iPS細(xì)胞的成功誘導(dǎo)比較復(fù)雜，誘導(dǎo)率比較低，科學(xué)家不依靠所謂的“基因搭載”也可以產(chǎn)生iPS 細(xì)胞，4 種關(guān)鍵因子現(xiàn)在已作為蛋白質(zhì)注射被應(yīng)用。但是由于對(duì)于細(xì)胞(包括iPS細(xì)胞、ES細(xì)胞和成體干細(xì)胞)自我更新與分化等行為的調(diào)控機(jī)制知之甚少，目前人們還不能按照自己的意圖將干細(xì)胞在體外定向誘導(dǎo)分化為所需要的任何的功能細(xì)胞。這些細(xì)胞在分化成神經(jīng)元的能力上是具有缺陷的，其并不像培養(yǎng)皿中的正常細(xì)胞一樣容易遷移。此外，Park等和Soldner等建立了多種遺傳病患者特異性的iPS細(xì)胞系，包括帕金森病、亨廷頓病、唐氏綜合征／三染色體21等。Dimos等和Ebert等 分別建立了肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)和脊髓性肌萎縮(SMA)患者特異性iPS細(xì)胞。Park等將人iPS細(xì)胞體外分化并分離得到原始生殖細(xì)胞(PGCs)。Wemig等將iPS細(xì)胞分化為神經(jīng)前體細(xì)胞，然后把這些細(xì)胞移植入胎鼠腦中，它們可整合到受體鼠的腦中，13．5 d后形成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞，包括谷氨酰胺能神經(jīng)元、GABA 能神經(jīng)元、兒茶酚胺能神經(jīng)元細(xì)胞。紅細(xì)胞體外培育的成功為人類研究通用紅細(xì)胞提供了新的契機(jī)。Hanna等l26J將患病小鼠尾尖成纖維細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞，然后通過同源重組的方法用人野生型pA．珠蛋白基因替代了ps．珠蛋白基因，接著把遺傳修飾后的iPS細(xì)胞定向分化為造血祖細(xì)胞(HPs)，并將純化后的HPs移植入hps／llps雄性小鼠中，HPs有效地抑制了鐮刀形紅細(xì)胞貧血癥癥狀。最近有研究報(bào)道，小鼠iPS 細(xì)胞通過與四倍體囊胚嵌合，成功生下具有正常生殖能力的完全由iPS 細(xì)胞發(fā)育而來的小鼠，這充分說明了iPS 細(xì)胞具有發(fā)育為完整個(gè)體的能力。根據(jù)動(dòng)物來源的不同，iPS 細(xì)胞成瘤時(shí)間也不盡相同，如小鼠的iPS 細(xì)胞約在1 個(gè)月左右能成瘤，但是豬的iPS 細(xì)胞需要1~3 個(gè)月時(shí)間才能成瘤。完全重編程的iPS 細(xì)胞應(yīng)具有體外分化潛能，能夠分化為各個(gè)胚層的不同類型的細(xì)胞，如外胚層的神經(jīng)細(xì)胞、上皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等；中胚層的肌肉細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等；內(nèi)胚層的肝細(xì)胞、胰島細(xì)胞等。此外，為了明確iPS 細(xì)胞的永生化能力，還需檢測(cè)其端粒酶活性。包括其多能性細(xì)胞特異的標(biāo)志基因的表達(dá)情況，向3 個(gè)胚層分化的潛能和自我更新能力，此外還涉及外源基因的沉默，及iPS 明確的遺傳背景。同時(shí)，有的受體細(xì)胞自身也表達(dá)部分的誘導(dǎo)因子，這不僅可以減少外源基因的使用數(shù)量，同時(shí)也減輕了重編程的負(fù)擔(dān)，進(jìn)而可以得到較高的iPS 誘導(dǎo)效率，且減少誘導(dǎo)的時(shí)間，例如神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)為iPS 細(xì)胞。另外，神經(jīng)干細(xì)胞本身表達(dá)較高的內(nèi)源性Sox2 等因子，當(dāng)采用Oct4 一個(gè)因子時(shí)，也能產(chǎn)生較高效率的iPS 細(xì)胞。這可能是由于胎兒細(xì)胞增殖活力強(qiáng)，并且甲基化程度較低，易于重編程。Klf4即是抑癌基因又是原癌基因,一方面可以促進(jìn)ES細(xì)胞的自我更新,另一方面在體細(xì)胞中強(qiáng)制表達(dá)可抑制DNA的復(fù)制,阻滯細(xì)胞周期于G1/S期,因此它在細(xì)胞增殖和分化之間起開關(guān)作用[2]。　　Sox2是胚胎干細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子,其與Oct4一樣均為體細(xì)胞重編程所必須的基因,除了可與Oct4協(xié)同調(diào)節(jié)維持細(xì)胞的多能性之外,還能促進(jìn)干細(xì)胞向神經(jīng)外胚層分化。從而使體細(xì)胞從分化狀態(tài)重編程為多能干細(xì)胞。ES細(xì)胞和ips細(xì)胞具有相同的基因。它的功能幾乎可以和ES細(xì)胞相媲美。2006年8月，通過對(duì)卵母細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞中涉及細(xì)胞重編程的細(xì)胞因子的深入分析和研究，日本科學(xué)家Takahashi 和Yamanaka 研究小組將24 種轉(zhuǎn)錄因子排列組合導(dǎo)入小鼠成纖維細(xì)胞，最終確定有4 種轉(zhuǎn)錄因子組合———OctSoxcMyc 和Klf4 即可將成纖維細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells )iPS細(xì)胞。因此科學(xué)家們努力尋求從法律、道德和倫理等方面更易被人們接受的體細(xì)胞核重編程的方法。其重編程過程包括染色體結(jié)構(gòu)重建、DNA甲基化、組蛋白乙酰化、印記基因表達(dá)、端粒長度恢復(fù)以及x染色體失活等。細(xì)胞重編程的方法包括體細(xì)胞核移植、miRNA干擾細(xì)胞質(zhì)重編程技術(shù)、多能干細(xì)胞和體細(xì)胞融合、多能細(xì)胞的提取物與體細(xì)胞共孵育等。但是這些方法最大的缺點(diǎn)就是供卵缺乏、倫理道德及政府法規(guī)的限制等。正如兩棲動(dòng)物中一樣，細(xì)胞核移植進(jìn)入小鼠卵母細(xì)胞后表明體細(xì)胞核重編程成為多能肽。ips細(xì)胞除了不能生成胚胎以外，可以產(chǎn)生所有的細(xì)胞，如果用于醫(yī)療，那么理論