【正文】 相表面上發(fā)生。也可在板孔中加入稀釋液，再在其中加入血清標本，然后在微型震蕩器上震蕩1分鐘以保證混和。加樣時應將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。自配的緩沖液應用pH計測量較正。反復凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存。如在冰箱中保存過久，其中的可發(fā)生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深。在ELISA中血漿和血清可同等應用。大部分ELISA檢測均以血清為標本。ELISA的操作因固相載體的形成不同而有所差異，國內(nèi)醫(yī)學檢驗一般均用板式點。陽性對照品中含量約為10ng/ml。陰性對照品須先行檢測，確定其中不含待測物質(zhì)。 　酶反應終止液常用的HRP反應終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式ELISA中一般采用2mol/L。產(chǎn)物為黃色的對硝基酚，在405nm波長處有吸收峰。HRP對氫受體的專一性很高，僅作用于H2O小分醇的過氧化物和尿素過氧化物(urea peroxide)。酶反應用HCL或H2SO4終止后，TMB產(chǎn)物由藍色呈黃色，可在比色計中定量，最適吸收波長為405nm。% H2O2的應用液,只需加入OPD后即可作為底物應用液。曾有報道OPD有致異變性，操作時應予注意。azinodi(3 ethylbenziazobine sulfonate6)]。在ELISA中，DH2一般為無色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物，以便作比色測定。為避免結(jié)合物在反應中直接吸附在固相載體上，在稀釋緩沖液中常加入高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)（例如1%牛血清白蛋白），通過競爭以抑制結(jié)合物的吸附?，F(xiàn)在較先進的ELISA試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作液，使用時不需再行稀釋，在48℃保存期可達6個月。　結(jié)合物的保存酶標抗體中的酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，保存不當，極易失活。最適的工作濃度就是指結(jié)合物稀釋至這一濃度時，能維護一個低的本底，并獲得測定的最佳靈敏度，達到最合適的測定條件和測定費用的節(jié)省。用離子交換層析或分子篩分離更為可取，高效液相層析法可將制備的結(jié)合物清晰地分成三個部分：游離酶、游離抗體和純結(jié)合物而取得最佳的分離效果，但費用較貴。但游離的抗體則不同，它會與酶標抗體競爭相應的固相抗原，從而減少了結(jié)合到固相上的酶標抗體的量。酶標記物按克分子比例聯(lián)結(jié)，其最佳比例為：酶/抗體=12/1。兩步法的產(chǎn)物中絕大部分的酶與蛋白質(zhì)是以1:1的比例結(jié)合的，較一步法的酶結(jié)合物更有助于本底的改善以提高敏感度，但其偶聯(lián)的有效率較一步法低。它具有操作簡便、有效（結(jié)合率達60%70%）和重復性好等優(yōu)點。堿性磷酸一般用此法進行標記。)2進行標記，則更可避免標本中RF的干擾。在ELISA中，AP系統(tǒng)的敏感度一般高于HRP系統(tǒng)，空白值也較低，但AP價格昂貴，制備結(jié)合物所得率也較HRP低。酶制劑的活力以所含的酶活力單位表示，可用對底物作用后生成產(chǎn)物量的測定進行試驗。HRP的純度用RZ(Reinheit Zahl，德文，意為純度數(shù)）表示，是403nm的吸光度與280nm吸光度之比，高純度的HRP的RZ≥?.0。在少數(shù)商品ELISA試劑中，應用的酶尚有葡萄糖氧化酶、βD半乳糖苷酶和脲酶等?！∶赣糜贓LISA的酶應符合以下要求：純度高，催化反應的轉(zhuǎn)化率高，專一性強，性質(zhì)穩(wěn)定，來源豐富，價格不貴，制備成酶結(jié)合物后仍繼續(xù)保留它的活性部分和催化能力。ELISA技術(shù)講座四試劑的選擇下 　結(jié)合物結(jié)合物即酶標記的抗體（或抗原），是ELISA中最關(guān)鍵的試劑。一般說來，雙抗體夾心法，只要酶標記物是高活性的，操作時洗滌徹底，不經(jīng)封閉也可得到滿意的結(jié)果。脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑，其最大的特點是價廉，可以高濃度使用（5%）。 　　封閉封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。~8的TrisHCL緩沖液作為稀釋液的。如需用高親和力的抗體包被以提高試驗的敏感性，則可采用親和層析法以除去抗血清中含量較多的非特異性IgG。 　包被用抗體包被固相載體的抗體應具有高親和力和高特異性，可取材于抗血清或含單克隆抗體的腹水或培養(yǎng)液。多肽抗原的包被一般需先使其與無關(guān)蛋白質(zhì)如牛血清白蛋白質(zhì)（BSA）等偶聯(lián)，借助于偶聯(lián)物與固相載體的吸附，間接地結(jié)合到固相載體表面。目前檢測抗HCV ELISA中所用包被抗原大多為根據(jù)HCV的基因克隆表達而制備的重組抗原。重組抗原的優(yōu)點是除工程菌成份外，其他雜質(zhì)少，而且無傳染性，但純化技術(shù)難度較大。 　包被用抗原 用于包被固相載體的抗原按其來源不同可分為天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。固相載體先用堿性蛋白質(zhì)，如聚賴氨酸、魚精蛋白等作預包被，也可提高核酸的結(jié)合力。間接包被的另一優(yōu)點是抗原用量少，僅為直接包被的1/10乃至于/100。蛋白質(zhì)抗原大多也可采用與抗體相似的方法包被。蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用于。其優(yōu)點是表面積極大，反應在懸液中進行，其速率與液相反應近似。小試管作為固相載體也有較大的吸附表面，而且標本的反應量也相應增加。吸附面積的增大即意味著固相抗原或抗體量的增加。為比較不同固相在某一ELISA測定中的優(yōu)劣，可應用如下的試驗：用其他免疫學測定方法選出一個典型的陽性標本和陰性標本，將它們進行一系列稀釋后，在不同的固相載體上按預定的ELISA操作步驟進行測定，然后比較結(jié)果。所有單個讀數(shù)與全部讀數(shù)的均數(shù)之差，應小于10%。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別，各種產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大，因此，每一批號的ELISA板在使用前須事先檢查其性能。ELISA板的特點是可以同時進行大量標本的檢測，并可在特制的比色計上迅速讀出結(jié)果。聚苯乙烯為塑料，可制成各種形式。以下簡述固相載體和包被過程。前文（）已述，ELISA中有三個必要的試劑：免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的底物。在早期，親和素從蛋清中提取，這種卵親和素為堿性糖蛋白，與聚苯乙烯載體的吸附性很強，用于ELISA中可使本底增高。生物素與親和素的結(jié)合具有很強的特異性，其親和力較抗原抗體反應大得多，兩者一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)定。 ABSELISA法ABS為親和素(avidin)生物素(biotin)系統(tǒng)(system)的略語。此法常用于病毒性感染的早期診斷。先用抗人IgM抗體包被固相，以捕獲血清標本中的IgM（其中包括針對抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM）。間接法ELISA一般僅適用于檢測總抗體或IgG抗體。其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結(jié)合。競爭法測抗體有多種模式，可將標本和酶標抗體與固相抗原競爭結(jié)合，抗HBc 　　ELISA一般采用此法。標本中抗體量越多，結(jié)合在固相上的酶標抗體愈少，因此陽性反應呈色淺于陰性反應。因此在間接法中，抗原包被后一般用無關(guān)蛋白質(zhì)（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封閉（blocking）固相上的空余間隙。另外如抗原中含有無關(guān)蛋白，也會因竟爭吸附而影響包被效果。間接法成功的關(guān)鍵在于抗原的純度。固相免疫復合物中的抗體與酶標抗體抗體結(jié)合，從而間接地標記上酶。血清中的特異抗體與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復合物。其原理為利用酶標記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法（見圖23）。此法中受檢標本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法。雙抗體夾心法適用于測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用于測定半抗原及小分子單價抗原，因其不能形成兩位點夾心。用作雙抗體夾心法檢測的血清標本中如含有RF，它可充當抗原成份，同時與固相抗體和酶標抗體結(jié)合，表現(xiàn)出假陽性反應。假使在被測分子的不同位點上含有多個相同的決定簇，例如HBsAg的a決定簇，也可用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結(jié)合物。類同于沉淀反應中抗原過剩的后帶現(xiàn)象，此時反應后顯色的吸光值（位于抗原過剩帶上）與標準曲線（位于抗體過剩帶上）某一抗原濃度的吸光值相同（，圖14），如按常法測讀，所得結(jié)果將低于實際的含量，這種現(xiàn)象被稱為鉤狀效應（hook effect），因為標準曲線到達高峰后呈鉤狀彎落。如抗體的來源為抗血清，包被和酶標用的抗體最好分別取自不同種屬的動物。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結(jié)合。2） 加受檢標本，保溫反應。在這種測定方法中有三個必要的試劑：（1）固相的抗菌素原或抗體，即免疫吸附劑（immunosorbent）；（2）酶標記的抗原或抗體，稱為結(jié)合物（conjugate）；（3）酶反應的底物。此時固相上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。如前所述，固相載體可用作一種分離手段。在均相EIA中可不需進行游離的和結(jié)合的標記物的分離而直接測定標記物?？刹捎枚喾N手段，固相載體是其中之一。在放射免疫測定和酶免疫測定中，標記物分別為放射性核素和酶，最后用測定放射性和酶活力來計算待檢物的量，敏感度可比直接測定沉淀物提高數(shù)百至數(shù)千倍。4) 病原體抗原，HBsAg、HBeAg等。例如，用放射免疫測定法或酶免疫測定法測定HBsAg。在臨床檢驗中，如用抗hCG抗血清作為妊娠診斷試劑檢定尿液中hCG，只能用于hCG濃度較高的試驗，否則婦女生理性排泄入尿液中的微量LH將與之發(fā)生交叉反應。但是這種特異性也不是絕對的?！√禺愋钥乖贵w的結(jié)合實質(zhì)上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結(jié)合位點之間。在等價帶前后分別為抗體過剩帶和抗原過剩帶。在抗血清中，特異性的IgG抗體僅占總IgG中的極小部分。Ab]／[Ag][Ab]Ag右圖為為甲型肝炎病人血清中IgG抗體和IgM抗體出現(xiàn)的時間和水平。機體被微生物感染后，先產(chǎn)生IgM抗體，然后產(chǎn)生IgG抗體。IgG可被胃蛋白酶分解為兩個片段，一個Fab雙體，稱F（ab39。兩者構(gòu)成抗體的抗原結(jié)合部位，只與相應的抗原決定簇匹配，發(fā)生特異性結(jié)合（見圖），是抗體專一性結(jié)合抗原的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。IgG的結(jié)構(gòu)見圖。Ig由兩個輕鏈（L）和兩個重鏈（H）的單體組成。現(xiàn)在國內(nèi)已有相當數(shù)量的單位擁有全自動酶標儀，這對于實現(xiàn)ELISA標準化檢測、提高檢測質(zhì)量起到了重要作用。 板 讀板時板底不清潔。 止 加終止液時產(chǎn)生較多氣泡，導致假陽性增加。 1. 顯色劑盡量在臨用前配制，堅持不用過期顯色劑，肉眼可見淺藍色的TMB顯色劑不用； 2. 加樣時保持顯色劑不外流； 、B液應避免接觸金屬器械。 顯 。 ，請分批操作。 ：最好將血液先自然存放12小時后，再用3000rmp離心15分鐘；標本為血漿：必須使用含抗凝劑的血液標本收集管，采血后必須立即顛倒采血管混合510次，放置一段時間后，3000rpm離心15分鐘；若在幾天內(nèi)檢測，可放在28℃冰箱中，若要貯存，則置于20℃的低溫冰箱內(nèi)。 操作步驟 可能原因 解決辦法 我將操作中各個環(huán)節(jié)常出現(xiàn)問題的原因及解決辦法總結(jié)于下，以期給同行帶來一些啟發(fā)，提高試驗質(zhì)量。 加 ，最好選擇FAME或其他后處理儀器加酶試劑。 孵 ； 。 洗 ，洗液量不足，導致洗板不徹底；洗板針堵塞，抽吸不完全；洗板不暢，導致洗板效果差。 ，有效提高檢測質(zhì)量。 在實際操作中，除了選擇優(yōu)良試劑外，必須嚴格按照操作步驟進行操作，同時作好室內(nèi)質(zhì)控、室間質(zhì)評，以嚴謹?shù)墓ぷ髯黠L檢測每一份標本，才能保證檢測質(zhì)量。與免疫測定有關(guān)的Ig主要為IgG和IgM。IgG和IgM的重鏈分別稱為γ（gamma）鏈和μ（mu）鏈。 ② 胃蛋白酶裂解部位重鏈和輕鏈的N端的氨基酸排列順序因各種抗體而異，稱為可變區(qū)，分別用VH和VL表示。另一區(qū)段稱Fc段，無抗體活性，但具有IgG特有的抗原性。IgM分子量約為900000，IgG分子量約為150000。因此IgM抗體的測定，對某些傳染病如甲型肝炎有較高的臨床診斷價值。Ab抗體的親和力（affinity）是抗原抗體間的固有結(jié)合力，可以用平衡常數(shù)K表示：K=[Ag解離后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性，因此可用親和層析法來提純抗原或抗體。曲線的高峰部分是抗原抗體比例最合適的范圍，稱為等價帶（zone of equivalence）。在用免疫學方法測定抗原時，應使反應系統(tǒng)中有足夠的抗體量，否則測得的量會小于實際含量，甚至出現(xiàn)假陰性?？乖贵w反應的這種特異性使免疫測定能在一非常復雜的蛋白質(zhì)化合物（例如血清）中測定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。用hCG免疫動物所得的抗血清中含有抗αhCG和抗βhCG兩種抗體，抗αhCG抗體將與LH中的α酶位發(fā)生交叉反應。標記的免疫測定的敏感度可提高數(shù)千倍，達ng/ml水平。3) 抗生素和藥物。標記的免疫測定是將檢測試劑中的抗原或抗體用可微量測定的物質(zhì)加以標記，通過測定標記物來提高敏感度。因此，游離標記物與結(jié)合標記物的分離是標記免疫測定中的重要步驟。6． 酶免疫測定酶免疫測定（enzyme immunoassay）可分為均相（homogenous）和非均相（heterogenous）兩種類型。非均相EIA需先進行游離的和結(jié)合的標記物的分離。 ELISA的原理和類型1.　ELISA的原理ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應而結(jié)合在固相載體上。2.　ELISA的類型ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。3） 加酶標抗體，保溫反應。4） 加底物顯色。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法。在一步法測定中，當標本中受檢抗原的含量很高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結(jié)合，而不再形成夾心復合物。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應。RF是一種自身抗體，多為IgM型，能和多種動物IgG的Fc段結(jié)合。雙抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響，已被列為這類試劑的一項考核指標（）。與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體。 間接法測抗體　　間接法是檢測抗體常