【正文】 B12—維生素 12 中壓 GFC的 HETP與線速度的關(guān)系 (759) CuBuAH E T P ???正常操作下，HETP為凝膠粒徑的 2－ 3倍 影響分離特性的因素 2. 料液體積 為得到較高的分離度，料液體積需根據(jù)溶質(zhì)之間分配系數(shù)的差別控制在適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)，在不影陶分離度的前提下取最大值。 瓊脂糖凝膠是另一種較常使用的凝膠過(guò)濾介質(zhì)。 RPC分離合成蛋白質(zhì)混合液 RPC柱： φ 35， TSK gel Octadecyl—NPR 洗脫液 A： 含 ％ TFA的水溶液 洗脫液 B： 含 ％ TFA的乙腈溶液 線性梯度： 15％ → 80％ B(10min) 流量＝ ／ min； 1－核糖核酸酶； 2－胰島素； 3－細(xì)胞色素 C； 4－ 溶菌酶； 5－乳白蛋白； 6－肌紅蛋白； 7－卵清蛋白 凝膠過(guò)濾 (GFC) 分離原理 洗脫曲線 分離原理 msd ccK ? GFC操作中 溶質(zhì)的分配系數(shù) Kd只是相對(duì)分子質(zhì)量、分子形狀和凝膠結(jié)構(gòu) (孔徑分布 )的函數(shù)，與所用洗脫液的 pH值和離子強(qiáng)度等物性無(wú)關(guān)，即在一般的色譜操作條件下，相對(duì)分子質(zhì)量一定的 溶質(zhì)的分配系數(shù)為常數(shù) 。 極性較強(qiáng)的組分先被沖洗出，而極性弱的組分在色譜柱上有更強(qiáng)的保留。 所用填料常以硅膠為基質(zhì)，表面鍵合有極性相對(duì)較弱官能團(tuán)的鍵合相。 徑向色譜柱原理示意圖 a—垂直斷面示意圖 b—水平斷面示意圖 為解決大直徑色譜柱分離效果較差的問(wèn)題，近年來(lái)發(fā)展了徑向色譜柱技術(shù)，從原理上解決了色譜柱技術(shù)所存在問(wèn)題。在分離能力擴(kuò)大同時(shí)，要盡可能維持產(chǎn)物收率和純度不改變。 Rs＞ l時(shí)，溶質(zhì)的分離已較好。 (757) HETP與流速的關(guān)系 (759) CuBuAH E T P ??? 液相色譜條件下，分子擴(kuò)散的影響可忽略不計(jì) [即式中 A近似為零 ]。 假定洗脫色譜分離的傳質(zhì)單元數(shù) N類似于分離級(jí)數(shù)，在上述式 (739)中，若用傳質(zhì)單元數(shù) N取代級(jí)數(shù)，則有： ]/2)1/(e xp []2)1/(e xp [2002200NttCttCC??????? (754) (755) uk aLHLN ???21?式中： ? ??CC CCdCN0* 傳質(zhì)單元高度 傳質(zhì)單元數(shù) 實(shí)際色譜過(guò)程中存在傳質(zhì)阻力 (如固定相表面液膜擴(kuò)散和內(nèi)擴(kuò)散 )，溶質(zhì)在兩相間的分配平衡不可能瞬間完成，而需要一定的柱高。 對(duì)多數(shù)的生化分離過(guò)程，通常受第 2和第 4步的內(nèi)部擴(kuò)散速度控制，因?yàn)槟康漠a(chǎn)物常是生物大分子，其擴(kuò)散系數(shù)小。樣品在置換劑推動(dòng)下沿色譜柱前進(jìn)，因樣品各組分的作用力不同，向下移動(dòng)的速率也就不同，最先從柱中被置換出來(lái)的是作用力最弱的溶質(zhì)，最后出來(lái)的是置換劑本身。前沿分析法的一個(gè)顯著特點(diǎn)是 分離過(guò)程中樣品溶液本身就是流動(dòng)相，組分的濃度不會(huì)像洗脫展開(kāi)中那樣逐漸稀釋。 在前沿分析法中，樣品溶液不是作為一部分進(jìn)入色譜柱，而是連續(xù)不斷地輸入色譜柱，樣品溶液本身起流動(dòng)相的作用。 (1) 恒定洗脫法 (2) 逐次洗脫法 洗脫劑的組成至少改變一次。 (二 )展開(kāi)操作 是應(yīng)用最廣的一種方法。以容量式和質(zhì)量式較為方便實(shí)用。柱直徑多為 2—15cm。除廣泛用于凝膠過(guò)濾外，還可進(jìn)行化學(xué)改性而得到含有多種官團(tuán)的離子交換吸附劑及親和吸附吸附劑。聚丙烯酰胺親水性好， pH 1～ 10范圍內(nèi)穩(wěn)定，不為生物降解，在色譜分離中有廣泛用途。機(jī)械強(qiáng)度比葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠都好。 由于多糖骨架上有大量羥基，使得它的親水性比 Sepharose還強(qiáng)。 用環(huán)氧氯丙烷使瓊脂糖交聯(lián)，可增強(qiáng)基質(zhì)穩(wěn)定性，調(diào)節(jié)交聯(lián)劑和瓊脂糖的比例可控制凝膠珠體的孔度大小。 活性炭柱色譜分離樣品上柱量大，分離效果好，來(lái)源較易，價(jià)格便宜，適用于大量制備性的分離。 用于生物產(chǎn)品分離的色譜柱應(yīng)盡可能滿足下述要求： (1)分離能力強(qiáng) ： (2)分離速度高； (3)處理能力大 ； (4)目的產(chǎn)物回收率高 ， 生物活性損失小 ； (5)使用壽命長(zhǎng) ， 可再生 ， 要求可反復(fù)再生使用半年以上； (6)成本較低 ， 價(jià)格合理 。 對(duì)于中等分子，能進(jìn)入部分凝膠空間， 0＜ Kd＜ 1。 凝膠色譜 凝膠色譜分離已成為一種通用的分離方法，在生物大分子物質(zhì)的制備與生產(chǎn)技術(shù)中被廣泛應(yīng)用。 吸附色譜 吸附色譜分離就是根據(jù)吸附劑 (固定相 )對(duì)不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物分離的。 隨著洗脫劑加入 ， 兩組分將逐漸分開(kāi) ， 親和力弱的“△” 分子移動(dòng)快 ， 先從色譜中分離出來(lái) ， 親和力強(qiáng)的“ 〇 ” 分子后從色譜柱中出來(lái) 。 對(duì)于 生物小分子 的代謝物 ， 由于它們分子量小 、 結(jié)構(gòu)和性質(zhì)比較穩(wěn)定 、 操作條件不太苛刻 ， 采用吸附 、 分配和離子交換色譜進(jìn)行分離較為適宜 。 (3)根據(jù)洗脫操作分類 根據(jù)洗脫時(shí)展開(kāi)方式的不同，可分為 洗脫展開(kāi)法 、 前沿分析法 和 置換展開(kāi)法 3種。 按固定相形狀不同分類 (1)柱色譜 (2)紙上色譜 進(jìn)樣量大，回收容易?；旌衔镫S流動(dòng)相流經(jīng)凝膠柱時(shí)，較大分子不能進(jìn)入所有的凝膠網(wǎng)孔而受到排阻，與流動(dòng)相一起首先流出；小分子能進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔，凝膠柱中流出次序靠后。 離子交換色譜廣泛用于生物大分子分離純化，特別是在蛋白質(zhì)、多肽、核酸等生物物質(zhì)的分離純化。 分配色譜流動(dòng)相和固定相都是液體，利用混合物中各物質(zhì)在兩液相中的分配系數(shù)不同而分離。 當(dāng)多組分混合物隨流動(dòng)相流動(dòng)時(shí)，由于各組分物理、化學(xué)性質(zhì)的差別，而以不同的速率移動(dòng)，使之分離、純化。 (2)應(yīng)用范圍廣 從極性到非極性、離子型到非離子型、小分子到大分子、無(wú)機(jī)到有機(jī)及生物活性物質(zhì)，以及熱穩(wěn)定到熱不穩(wěn)定的化合物，都可用色譜法分離。從多數(shù)生物產(chǎn)品純化工藝來(lái)講， 色譜分離是產(chǎn)品包裝前的最后純化工序 。第 7章 色譜分離技術(shù) 基本原理 分配色譜 凝膠過(guò)濾 離子交換 親和色譜 基本原理 概述 1903年 俄國(guó)植物學(xué)家茨維持 (Ц в е т ， Tswet) 在 填充碳酸鈣柱中用 以石油醚沖洗 植物色素萃取物，得到各色區(qū)帶 。 1950年代 氣相色譜出現(xiàn)，色譜分離的儀器化 1960年代 高效液相色譜的發(fā)展，高效固定相填料獲得突破進(jìn)展 隨著生物技術(shù)的發(fā)展，色譜分離已成為生物產(chǎn)品高度純化最有效的 的 方法 之一。 通常色譜柱長(zhǎng)一般只有幾厘米至幾十厘米。 (6)過(guò)程自動(dòng)化操作 色譜 /層析 /色層機(jī)理： 利用多組分混合物中各組分 物理、化學(xué)性質(zhì)的差別 ，使各組分以不同程度分布在固定相和流動(dòng)相中。新型吸附色譜技術(shù)，如疏水作用色譜 、 金屬整合作用色譜和共價(jià)作用色譜等。 該法適合于離子和在溶劑中發(fā)生電離物質(zhì)的分離。 凝膠是不帶電荷的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，每個(gè)凝膠顆粒的細(xì)微結(jié)構(gòu)就如一個(gè)篩子。 (五 )親和色譜 (Affinity Chromatography， AFC) 廣泛用于定性與定量分析，不用于制備和生產(chǎn)。 其他分類方法 (1) 根據(jù)流動(dòng)相的物態(tài)分類 氣相色譜