【正文】 SPF 級雞蛋，質(zhì)量難于控制，方法難于標(biāo)準(zhǔn)化；雞胚帶有潛在的外源病毒污染可能；用雞胚尿囊液所分離的流感病毒或傳代易引起抗原型變異；手工操作性，培養(yǎng)周期過長，不易于控制產(chǎn)量，不利于大規(guī)模生產(chǎn)；尤其是一旦大流行發(fā)生，很難在短期內(nèi) 選擇出適應(yīng)雞胚尿囊腔生長的變異株，并且種蛋的供應(yīng)也是個問題，難以應(yīng)對流感大暴發(fā)。 開始于 20 世紀(jì) 30 年代初，當(dāng)時用受染的小鼠肺所制成的勻漿液中的流感病毒，經(jīng)甲醛滅活接種動物 ，然后用流感野毒株皮下和腹腔內(nèi)攻擊 ，以了解其是否有免疫功能，顯然這不適用于人類。 接種疫苗的必要性 對流感滅活疫苗效力和有效性的研究表明 ,接種該疫苗有巨大裨益。 GuillainBarr233。 制作亞單位疫苗 ,需先將病毒的內(nèi)部蛋白剔除 只留有含高度純化的病毒表面抗原血凝素和神經(jīng)氨酸酶 ,不良反映顯著減少 ,不僅適用于成人 ,尤其適于兒童 .第四代疫苗為佐劑疫苗 ， 1997 年開始應(yīng)用于臨床，在實踐中發(fā)現(xiàn)，亞單位疫苗雖然不良反應(yīng)減少 ，但其免疫原性不如全病毒顆粒， 接種后特別是老年人群保護(hù)性抗體產(chǎn)生不理想 ，為此在亞單位疫苗基礎(chǔ) 研制成佐劑疫苗 從而提高了亞單位疫苗的免疫原性和預(yù)防效果。在出現(xiàn)產(chǎn)抗體細(xì)胞之前，已出現(xiàn)對流感有特異性的細(xì)胞毒性 T淋巴細(xì)胞 ,起限制感染的作用。 HAI 抗體滴度≥ 1:40(或中和抗體滴度＞ 1:8)就具有免疫力。初次感染后大約 1～ 2 周 ,血清中出現(xiàn)中和抗體、血凝抑制 (HAI)抗體及抗 NA 抗體，約在 3～ 4 周達(dá)到高峰。無并發(fā)癥患者發(fā)病后 3～ 4 天開始恢 復(fù)，而且恢復(fù)徹底。無慢性帶毒狀態(tài)，但在幼兒，病毒排出持續(xù)時間長于成人。乙型流感病毒的抗原性變異程度不如甲型流感病毒。該病毒從家雞和家鴨傳給人，引起 18 例確診病例，其中 6 例死亡。另一方面 ,“抗原性轉(zhuǎn)變”包括由不同甲型病毒株的遺傳物質(zhì)重配造成的大的變化，一般認(rèn)為由于動物中甲型流感混合感染引起的。因此具有效果好、產(chǎn)量高、生產(chǎn)迅速、起始材料易于控制、易于標(biāo)準(zhǔn)化、生產(chǎn)環(huán)境密閉以及保證的穩(wěn)定性和免疫原性等優(yōu)點。 Vero 細(xì)胞培養(yǎng)的流感疫苗誘導(dǎo)的 T 細(xì)胞增殖應(yīng)答和 Th1 型細(xì)胞因子的釋放明顯高于雞胚培養(yǎng)的疫苗。此后，細(xì)胞流感疫苗的研究取得了飛速發(fā)展。 因此流感疫苗的預(yù)防接種仍是當(dāng)今防止流感發(fā)生和流行的最有效的手段之一 。 1990 年在我國豬群中首次分離出豬型（ H1N1）流感病毒。 據(jù)了解，1977 年 5 月首發(fā)于我國東北地區(qū)的流感是由 H1N1 亞型流感病毒引起的，一年后波及全球。 基于上述情況， 通過廣泛的文獻(xiàn)檢索與反復(fù)試驗 ，本文研究了 各 (亞 )型流感病毒于 Vero 細(xì)胞內(nèi)的快速傳代， 流感病毒于細(xì)胞內(nèi)傳代穩(wěn)定性問題，為進(jìn)一步研制 Vero 細(xì)胞 培養(yǎng)流感的病毒 疫苗 提供一定的參考 。 摘 要 流感是由甲 (A)、乙 (B)、丙 (C)三型流感病毒分別引起的一種急性呼吸道傳 染病。其中 Vero 傳代細(xì)胞系解決了外源病毒和致癌性的問題，且易于大規(guī)模培養(yǎng)，被 WHO 推薦作為疫苗生產(chǎn)細(xì)胞 基質(zhì)之一， 使用哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)替代雞胚來生產(chǎn)流感疫苗將是大勢所趨。 特別是 1918 年意大利流感 ,估計全世界死 于流感的人數(shù)達(dá) 40005000 萬 ,有關(guān)資料還顯示人群病死率上升與流感的流行季節(jié)相關(guān) ，在美國每年因流感住院人數(shù)多于 100000 人，死亡近 40000 人， 盡管引起流感流行 ， 特別是大流行的機(jī)制還不十分清楚 ， 但較一致的看法是與流感病毒表面抗原變異和人群普遍缺少免疫力有 關(guān)。 1989 年在我國病馬中分離出 8 個基因節(jié)段類似于禽流感病毒的馬 2（ H3N8）亞型流感病毒。 2020 年 10 月科學(xué)家復(fù)原了 1918 年流感大流行的病毒基因組序列，證明是禽流感，與當(dāng)前全球流行的 H5N1 病毒有相似性，世界各國正嚴(yán)陣以待，預(yù)防全球 H5N1 流感大流行。 1995 年 2 月 16 日 WHO 在日內(nèi)瓦召開了關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)物作為生產(chǎn)流感疫苗 的基質(zhì)的會議，討論了幾個實驗室關(guān)于流感病毒在穩(wěn)定細(xì)胞系中培養(yǎng)的研究結(jié)果，并對下一步工作提出了建議。不管是經(jīng) Vero 細(xì)胞還是雞胚培養(yǎng)的疫苗，只有鼻內(nèi)接種活病毒疫苗的小鼠才檢出病毒特異性分泌型 IgA 抗體。而且在哺乳動物細(xì)胞中生長的流感病毒比雞胚培養(yǎng)分離的病毒更接近于臨床樣本中的病毒。微小突變不斷 在這些表面糖蛋白中產(chǎn)生小的變化，引起“抗原性漂移”。例如 ,1976 年美國發(fā)現(xiàn)“豬 4 發(fā)。大多發(fā)病較輕、且散在流行，但偶爾也可引起與甲型流感 病毒一樣嚴(yán)重的流行。在多數(shù)病例，從發(fā)病前 1～ 2 天到發(fā)病后 4～ 5 天，相當(dāng)于傳染期，在呼吸道標(biāo)本中可發(fā)現(xiàn)病毒。咽喉疼痛、鼻炎和無痰性咳嗽在全身癥狀消失后可持續(xù)數(shù)天。 一般認(rèn)為主要由血清抗體提供流感的防御作用 ,但幾乎可肯定粘膜 IgA抗體和細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答也可預(yù)防流感。該抗體對特定亞型內(nèi)的變異株有特異 性，由于在新的感染株中有抗原性改變，故保護(hù)作用可降低或失去。 IgA 抗體在感染后約 14 天達(dá)到高峰，可在唾液、鼻分泌物、痰和氣管洗液中檢出。第二代為裂解疫苗， 1968 年在美國首次 被批準(zhǔn)使用裂解疫苗 ，即用裂解劑如乙醚， 3N丁基磷酸鹽 , 聚山梨醇酯 80,脫氧膽酸鈉等 , 使病毒裂解成為含有病毒表面抗原血凝素和神經(jīng)氨酸 酶 , 核殼以及基質(zhì)蛋白的可溶性碎片 , 由于不含有全病毒疫苗中的各種脂類反應(yīng)原 , 經(jīng)純化后不良反應(yīng)大為減少 ,廣泛應(yīng)用于成人和兒童 . 第三代為病毒亞單位疫苗 ,1976年用于臨床 。最近的一些隨機(jī)對照試驗和一項大規(guī)模隊列研究已證實流感疫苗對哮喘病人的安全性。 2020 年確定了一種新的流感疫苗相關(guān)不良反應(yīng)：眼 呼吸道綜合征 (ORS2020),診斷標(biāo)準(zhǔn)是在免疫后 2～ 24 小時內(nèi)出現(xiàn)雙眼炎癥或呼吸道癥狀或臉面水腫 ,持續(xù) 48 小時以內(nèi)。一項對 2020 年前發(fā)表報道的薈萃分析顯示，疫苗接種可使流感樣疾病患者減少 35%，肺炎和流感的住院率減少 47%，總死亡率減少 50%，同時 流感疫苗接種還能預(yù)防心力衰竭、腦梗塞、復(fù)發(fā)性心肌梗塞和原發(fā)性心博停止，說明疫苗接種對心血管疾病患者有重要裨益。 新型 疫苗 — 細(xì)胞培養(yǎng)疫苗 雖然，采用雞胚培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)流感滅活疫苗已經(jīng)有 60 多年歷史，多年的臨床應(yīng)用表明其具有很好的免疫效果和臨床安全性，保護(hù)率一般為 75%～ 90%。此后，細(xì)胞流感疫苗的研究取得了飛速發(fā)展。研究證實 Vero 細(xì)胞培養(yǎng)的流感疫苗與雞胚培 養(yǎng)的流感疫苗在誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答方面免疫原性相仿 ,而在誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答方面 ,前者優(yōu)于后者。未來幾年內(nèi)，使用 哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)替代雞胚來生產(chǎn)流感疫苗將是大勢所趨。 未來幾年內(nèi)，使用哺 乳動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)替代雞胚來生產(chǎn)流感疫苗將是大勢所趨。 第 二章 流感病毒于 Vero細(xì)胞內(nèi)的適應(yīng)性 研究 對流感病毒在 Vero細(xì)胞內(nèi)繁殖的影響 研究 材料 流感病毒 A1/； A3/ ； B/Brisbane/60/2020。結(jié)果見表 1。 其他 MEM 培養(yǎng)基 、 小牛血清 、 胰蛋白酶 、 新霉素 、 谷氨酰胺 、 生理鹽水 DHank’s 液 主要儀器 臺式離心機(jī) (centrifuge 5415P,eppendorf) 倒置顯微鏡 (olympus) 細(xì)胞操凈臺 (蘇州凈化 ) 二氧化碳培養(yǎng)箱 (Thermoforma) 恒溫培養(yǎng)箱 (上海實驗儀器廠有限公司 ) 恒溫水浴箱 微量移液器 低溫冰柜 超低溫冰柜 家用冰箱 刻度吸管 血凝板 加液槽 漩渦振蕩器 細(xì)胞培養(yǎng)瓶 方法 選擇生長良好的單層 Ve ro 細(xì)胞，按試驗分組進(jìn)行編號后，棄舊培養(yǎng)液，用DHank’s 液 洗滌細(xì)胞面，控凈液體，按組接種經(jīng) 1:100、 1:1000、 1:10000 稀釋的流感毒種， 34℃177。 表 2 流感病毒的接種量研究方法及結(jié)果 8 毒種稀釋度 不同 (亞 )型流感病毒 H1N1 H3N2 B 1:100 1:8 1:32 1:16 1:1000 1:32 1:12 1:64 1:10000 1:16 1:64 1:32 結(jié)果 由表 2 可見，將流感病毒按 1:1000 稀釋后接種單層 Vero 細(xì)胞，可獲取最高的血凝效價。 1℃培養(yǎng)不同時間，每天抽樣后進(jìn)行檢測。 材料 流感病毒 A1/； A3/ ； B/Brisbane/60/2020 Vero 細(xì)胞。 第三 章 流感病毒在 Vero細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)的遺傳穩(wěn)定 性 研究 流感病毒 A1/； A3/ ； B/Brisbane/60/2020。抽取檢定用樣品后，置 70℃以下凍存。補(bǔ)加維持液后，置 34℃177。抽取檢定用樣品后，置 70℃以下凍存。 表 5 A1/ 在 Vero 細(xì)胞內(nèi)傳代穩(wěn)定性結(jié)果 檢定