【正文】 再加入其他成分依次溶解。 3H2 ， MgS04 10．無(wú)菌檢查 將滅菌的培養(yǎng)基放入 37℃溫箱中培養(yǎng) 24— 48h，無(wú)菌生長(zhǎng)即可使用。然后用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、日期。有些微生物需要更好的通氣，則可用 8 層紗布制成通氣塞。半固體培養(yǎng)基以試管高度的 1／ 3 為宜，滅菌后垂直待凝。 5．分裝 按實(shí)驗(yàn)要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶?jī)?nèi)。pH 的調(diào)節(jié)通常放在加瓊脂之前。 2．加熱溶解 在燒杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉網(wǎng)上，小火加熱，并用玻棒攪拌，待藥品完全溶解后再補(bǔ)充水分至所需量。其配方如下： 牛肉膏 3g，蛋白胨 10g， NaCl 5g，瓊脂 15～ 20g，水 1000mL， — 。 7H FeS04 2．高氏 1 號(hào)培養(yǎng)基的配制。 計(jì) 算 次 數(shù) 4 個(gè)大方格白細(xì)胞數(shù) 5 個(gè)大方格紅細(xì)胞數(shù) 1 2 3 4 總數(shù) 1 2 3 4 5 總數(shù) 第 1 次 第 2 次 兩次平 均總數(shù) 血細(xì)胞 計(jì) 數(shù) 圖 33 ABO 血型鑒定凝集反應(yīng)示意 圖 12 根據(jù)實(shí)驗(yàn)體會(huì)，說(shuō)明哪些因素可能影響血細(xì)胞記數(shù)的準(zhǔn)確性？應(yīng)如何盡量減少誤差，力求準(zhǔn)確？ 試述紅細(xì)胞凝集鑒定 ABO 血型的原理。 5．進(jìn)一步在低倍鏡下觀察有無(wú)凝集現(xiàn)象?！?切勿混用毛細(xì)滴管！為什么？ 手持玻片轉(zhuǎn)動(dòng)數(shù)次，轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)玻片應(yīng)保持在一個(gè)水平面上，然后置室溫下 5min 后觀察結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)采用平板法。 （ 3） 按目前臨床上血細(xì)胞計(jì)數(shù)采用的通用單位，將以上所獲每毫升血液中所含各血細(xì)胞數(shù)量換算為各血細(xì)胞在每升血液中的數(shù)量。 （ 2）紅細(xì)胞數(shù) 將中央大方格中的四角和中央的中方格共 5個(gè)中 方格內(nèi)數(shù)得的紅細(xì)胞總數(shù)乘以 10 000，即得每立方毫米血內(nèi)紅細(xì)胞的總數(shù)。 6．計(jì)算 （ 1）白細(xì)胞數(shù) 將四角的 4 個(gè)大方格內(nèi)數(shù)得的白細(xì)胞總數(shù)乘以 50，即得每立方毫米血液內(nèi) 的白細(xì)胞總數(shù)，也可將對(duì)角兩個(gè)大方格內(nèi)數(shù)得的白細(xì)胞總數(shù)乘以 100。一般應(yīng)一次充液使計(jì)數(shù)室內(nèi)充滿稀釋血液，若經(jīng)幾次充液，易形成氣泡，應(yīng)洗凈計(jì)數(shù)板和蓋玻片，干燥后重新充液。 4．充液 2 類血細(xì)胞計(jì)數(shù)分 2 次充液，方法如下。拭去附著于吸管尖端外部的血液。 用消毒干棉球拭去第 1 滴血液，待流出第 2 滴血成大滴時(shí)，用采血管吸血至 20mm3刻度 處。 3．采血及稀釋 （ 1）用 1 mL吸管準(zhǔn)確吸取 白細(xì)胞稀釋液，放入 1支干凈的小試管內(nèi)，加塞備用。每 1個(gè)大方格邊長(zhǎng) 1 mm，面積為 1mm2，體積為 mm3。 三、操作與觀察 （一）血細(xì)胞及血小板計(jì)數(shù) 1．血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的結(jié)構(gòu)（圖 31） 圖 31 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板為一塊特制的長(zhǎng)方形厚載玻片，在中部 1／ 3 面積處有 4 條槽。 2．學(xué)習(xí) ABO 血型的鑒定方法。并計(jì)算細(xì)胞直徑、細(xì)胞核直徑及核質(zhì)比的平均值?！?如果換用不同倍數(shù)的目鏡或物鏡，此數(shù)據(jù)能否采用？為什么？ （ 3）細(xì)胞體積、核體積和核質(zhì)比的計(jì)算公式： 圖 21 用鏡臺(tái)測(cè)微尺校正目鏡測(cè)微尺 橢圓形 V＝ 234 ab? (a、 b 為長(zhǎng)、短半徑） 圓球形 V＝ 334R? （ R 為半 徑） 核質(zhì)比 NP＝ Vn／ (Vc－ Vn）（ Vn為核的體積， Vc為細(xì)胞的體積） 2．大鼠肝細(xì)胞大小的測(cè)定 （ 1）染色 取一涂有肝細(xì)胞的載玻片，浸入卡諾氏固定液中固定 5－ 10min 滴 1 滴醋酸洋紅染液，蓋上蓋玻片，置顯微鏡下觀察，細(xì)胞核呈鮮紅色，細(xì)胞質(zhì)呈淺紅色。 ③在低倍鏡下將臺(tái)尺 (標(biāo)尺外圍有一小黑環(huán) )移至視野中央，然后換用測(cè)量時(shí)所用放大倍數(shù)的物鏡，調(diào)焦，使標(biāo)尺上的刻度清晰可見(jiàn)。目尺是一個(gè)可以放入目鏡內(nèi)的特制圓形玻片，在中央刻有不同形式的標(biāo)尺，多為直線式，長(zhǎng) 5mm，等分為 5大格、 50小格。 7．觀察 置顯微鏡下觀察，其中含 RNA區(qū)域被染成紅色，而含 DNA區(qū)域被染成藍(lán)綠色或淡綠色，注意 RNA、 DNA在細(xì)胞 中的分布區(qū)域。 3．固定 浸入卡諾氏固定液中固定 5— 10min。 6 （二）口腔粘膜細(xì)胞活體染色顯示線 粒體 將從口腔粘膜刮下的白色粘性物薄而均勻地涂在載玻片上，加一滴 ％詹納斯綠 B染液，染色 20min，蓋上蓋玻片，置顯微鏡下觀察，高倍鏡下可見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)無(wú)色，在細(xì)胞質(zhì)中散在一些藍(lán)綠色短桿狀和圓形顆粒，即為線粒體。 2．置低倍鏡下尋找輪廓較清楚的單個(gè)細(xì)胞并移至視野中央，再轉(zhuǎn)高倍鏡觀察。 二、材料與用品 （一）材料 人口腔粘膜細(xì)胞、大鼠。 2．學(xué)習(xí)并掌握測(cè)量細(xì)胞大小的基本方法。 四、作業(yè)與思考 1．總結(jié)使用顯微鏡應(yīng)特別注意的幾個(gè)問(wèn)題。二甲苯用量不宜過(guò)多，擦試時(shí)間應(yīng)短。然后從目鏡中觀察，用粗調(diào)焦螺旋極其緩慢地向上調(diào)節(jié)至出現(xiàn)物像為止，★ 注意勿將粗調(diào)焦螺旋轉(zhuǎn)動(dòng)方向搞反了，以免油鏡頭與載玻片相碰而損壞了鏡頭及玻片。 在高倍鏡下，將玻片中的被檢物按從上到下、從左到右的順 序移動(dòng)、觀察一遍，再 4 由低倍鏡轉(zhuǎn)高倍鏡反復(fù)觀察幾次，以熟練高倍鏡的使用。★玻片移動(dòng)方向與物像移動(dòng)方向的關(guān)系如何？ 若光線不適，可撥動(dòng)可變光闌的操縱桿，調(diào)節(jié)光線至適宜。轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)焦螺旋調(diào)節(jié)鏡臺(tái)與物鏡間的距離，從側(cè)面注視，以二者間距離 5mm為度。舊式顯微鏡應(yīng)首先將可變光闌的孔徑調(diào)至最大，將聚光器升至最高點(diǎn)，再將低倍鏡對(duì)準(zhǔn)通光孔，鏡頭離載物臺(tái)約 1cm。推動(dòng)操縱光圈的調(diào)節(jié)桿，就可調(diào)節(jié)光圈的大小，使上行的光線強(qiáng)弱適宜，便于觀察。反光鏡的方向可以任意轉(zhuǎn)動(dòng)調(diào)節(jié)，以選擇適合的角度收集來(lái)自任何方向的光線。 3．光源系統(tǒng) 由光源、聚光器和可變光闌構(gòu)成。每臺(tái)顯微鏡常備有幾個(gè)倍數(shù)不同的目鏡， 每個(gè)目鏡上分別標(biāo)有 等放大倍數(shù)。用低倍鏡觀察標(biāo)本時(shí)，用粗調(diào)焦螺旋調(diào)焦距。標(biāo)本移動(dòng)器上還帶有標(biāo)尺，可利用標(biāo)尺上的刻度尋找和記錄所觀察標(biāo)本的位置。調(diào)節(jié)左右鏡筒之間的水平距離，以適應(yīng)觀察者兩眼的眼間距，可使左右目鏡的視野 完全重合。 （ 2）鏡臂與鏡筒 鏡臂是鏡柱以上的一個(gè)斜柄，便于手把握。此處以介紹雙筒顯微鏡為 主（圖 1－ 1）。 通過(guò)觀察裝片，掌握顯微鏡的使用方法。 （二）內(nèi)容： 顯微鏡的各部分構(gòu)造，并理解其基本性能。 三、操作與觀察 （一）顯微鏡的構(gòu)造 普通光學(xué)顯微鏡是由機(jī)械系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)及光源系統(tǒng) 3 部分組成。其后方有一直立的短柱稱為鏡柱，它支持著鏡臺(tái)。由物鏡到目鏡的光線便由此通過(guò)。鏡臺(tái)上裝有標(biāo)本移動(dòng)器（或稱推進(jìn)尺），標(biāo)本移動(dòng)器上的壓片夾用以固定載玻片，鏡臺(tái)右下方有標(biāo)本移動(dòng)器調(diào)節(jié)螺旋，轉(zhuǎn)動(dòng)螺旋可前后左右移動(dòng)玻片標(biāo)本。粗、細(xì)調(diào)焦螺旋組合在一起，外周粗的螺旋為粗調(diào)焦螺旋，其升降距離較大，主要用于尋找目的物。 （ 1）目鏡 安裝在鏡筒上端，其結(jié)構(gòu)是在一個(gè)金屬圓筒上端裝有一塊較小的透鏡、下端內(nèi)側(cè)裝有一塊較大的透鏡，其作用是將物鏡所放大了的物像進(jìn)行再放大?！?如何計(jì)算顯微鏡的放大倍數(shù)？物鏡是顯微鏡獲得物像的主要部件，其作用為聚集來(lái)自光源的光線和利用入射光對(duì)被觀察的物體做第一次放大。平面鏡反光較弱，用于光線較強(qiáng)的情況；凹面鏡反光較強(qiáng)，用于光線較弱的情況。 （ 3）可變光闌 位于聚光器下面 ，由許多金屬片組成。 （ 3）對(duì)光 配置內(nèi)置式電光源的顯微鏡可直接打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，并調(diào)節(jié)光量，使視野內(nèi)的亮度達(dá)到明暗適宜，同時(shí)打開(kāi)光圈。 （ 4）調(diào)焦 光線對(duì)好后，將玻片標(biāo)本放在鏡臺(tái)上，有蓋玻片的一面朝上，被檢物體對(duì)準(zhǔn)鏡臺(tái)孔正中，用標(biāo)本移動(dòng)器上的壓片夾卡緊，然后調(diào)焦。如果觀察的目標(biāo) 不在視野中央，可調(diào)節(jié)標(biāo)本移動(dòng)器，使之恰好位于視野中央?！?此時(shí)能使用粗調(diào)焦螺旋嗎？為什么？ 由于顯微鏡下觀察的被檢物有一定厚度，故在觀察過(guò)程中必須隨時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)調(diào)焦螺旋，以了解被檢物不同光學(xué)平面的情況。滴 1滴香柏油于玻片標(biāo)本待觀察的區(qū)域上，將油鏡頭轉(zhuǎn)至工作位置，眼睛從側(cè)面注視，轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)焦螺旋，直至油鏡頭浸沒(méi)于香柏油內(nèi)，幾乎與載玻片相接觸，但不能相碰。使用完畢，將鏡頭從香柏油中脫離，取下玻片，用擦鏡紙擦去鏡頭和玻片上的香柏油，再用擦鏡紙蘸少許二甲苯擦拭鏡頭上的油跡，然后用干凈擦鏡紙擦去鏡頭上殘留的二甲苯。擦凈載物臺(tái)和物鏡，將各部分還原，★ 注意物鏡頭不可正對(duì)通光孔，裝鏡入箱。 5 實(shí)驗(yàn) 2 細(xì)胞的制片與觀察和細(xì)胞大小的測(cè)量 一、目的與內(nèi)容 （一）目的 1．學(xué)習(xí)動(dòng)物細(xì)胞標(biāo)本的涂片制作法和了解動(dòng)物細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)。 3．利用顯微鏡測(cè)微技術(shù)測(cè)量大鼠肝細(xì)胞及其細(xì)胞核直徑。 三、操作與觀察 （一）人口腔粘膜上皮細(xì)胞的制備與觀察 1．滴 1 滴 ％生理鹽水于載玻片中央，用無(wú)菌牙簽粗的一端輕輕地在口腔頰部刮幾下，將刮下的白色粘性物質(zhì)放入載玻片上的滴液內(nèi)，輕輕涂抹使分散均勻；用鑷子夾住一塊潔凈的蓋玻片的一邊，使另一邊與載玻片上的滴液邊緣接觸，然后 緩慢放下，防止產(chǎn)生氣泡，用吸水紙從蓋玻片邊緣吸去多余的液體?！?為什么？ 3．如細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察不夠清楚，可在蓋玻片一側(cè)滴 1 滴 mol／ L 碘液（也可采用％亞甲基藍(lán)或 ％中性紅染液），在蓋玻片另一側(cè)用吸水紙吸引，使碘液通過(guò)細(xì)胞進(jìn)行染色，再置顯微鏡下觀察，細(xì)胞質(zhì)染成淺黃色，而細(xì)胞核染成深黃色。 2．涂片 取一小塊肝臟，在一干凈的載玻片中央涂抹數(shù)下。 6．透明和封片 將涂片放入二甲苯中 10min，取出，滴 1 滴中性樹(shù)膠，蓋上蓋玻片（方法同前）。亦有全長(zhǎng)為， 2 mm，共等分為 200 小格，每小格長(zhǎng)度不變。 ②將臺(tái)尺置于載物臺(tái)上，有刻度的一面朝上。 目尺每小格實(shí)際測(cè)量長(zhǎng)度（μ m）＝（ 2條重合線間臺(tái)尺的格數(shù) 10） /2 條重合線間目尺的格數(shù)。 （ 3）數(shù)據(jù)處理 由細(xì)胞直徑和細(xì)胞核直徑計(jì)算出各細(xì) 胞及其細(xì)胞核的體積，算出各細(xì)胞的核質(zhì)比。 8 實(shí)驗(yàn) 3 血細(xì)胞的數(shù)量測(cè)定與血型鑒定 一、目的與內(nèi)容 （一）目的 1．學(xué)習(xí)人體微量采血和用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞直接鏡檢計(jì)數(shù)的方法。 紅細(xì)胞稀釋液、白細(xì)胞稀釋液、 75％乙醇（消毒酒精）、 95％乙醇、 ％生理鹽水、乙醚、蒸餾水、標(biāo)準(zhǔn) A、 B 血清。平臺(tái)中部各刻有 1 個(gè)含 9個(gè)大方格的方格網(wǎng)，為計(jì)數(shù)室。 2．采血管 采血管為一細(xì)長(zhǎng)、均勻的毛細(xì)玻璃管，其上有 2 個(gè)刻度，前端刻度指示的容量為10mm3，后端的為 20mm3，尾端與 1 個(gè) 帶孔的橡皮吸球相連。★ 采血時(shí)必須待皮膚上的消毒酒精揮發(fā)后才能穿刺，否則流出的血液不能成滴，無(wú)法吸取。 若血柱超出規(guī)定刻度 1～ 2mm，可用干棉球輕觸管口（此時(shí)須執(zhí)管于水平位置），吸去多余部分，使血液面恰至規(guī)定刻度處。輕 輕搖振試管 1～ 2min，以搖勻稀釋的血液，但不可用力過(guò)猛，以免發(fā)生泡沫。用小滴管吸取稀釋血液，并將管尖輕輕斜置于蓋玻片邊緣，讓稀釋血液緩慢流出，借毛細(xì)管現(xiàn)象而自動(dòng)流入計(jì)數(shù)室內(nèi)。 10 如計(jì)數(shù)白細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)各大方格的白細(xì)胞數(shù)相差 8個(gè)以上，計(jì)數(shù)紅細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)各中方格的紅細(xì)胞數(shù)最多與最少相差 20個(gè)以上時(shí)，則表示血細(xì)胞分布不均勻，必須將稀釋的血液搖勻后再重新充入計(jì)數(shù)室計(jì)數(shù)。這樣，把四角 4 個(gè)大方格內(nèi)數(shù)得的白細(xì)胞總數(shù)乘以 50（即 20 ＝ 50），即得每立方毫米血內(nèi)的白細(xì)胞總數(shù)。這樣把 5 個(gè)中方格內(nèi)數(shù)得的紅細(xì)胞總數(shù)乘以 10 000（即 200 50＝ 10000），即得每立方毫米血內(nèi)的紅細(xì)胞總數(shù)。 （二） ABO血型鑒定 血型鑒定有平板法和試管法?！?兩滴管切勿混用，為什么 ? 3．用采血針刺破左手無(wú)名指尖或耳垂皮膚采血，待血液出來(lái)后，用 2支毛細(xì)滴管吸圖 32 血細(xì)胞計(jì)數(shù)方式 實(shí)心圈表示應(yīng)計(jì)數(shù)的紅細(xì)胞 空心圈表示不應(yīng)計(jì)數(shù)的紅細(xì)胞 11 取血液，分別加入到玻片左、右兩側(cè)的血清內(nèi)，并攪拌，使標(biāo)準(zhǔn)血清與血液混勻。如果外觀略呈花邊狀或鋸齒狀，看上去有沉淀，則多為凝集；如果血滴呈均勻狀態(tài)，邊緣整齊，則多為不凝集。 四、作業(yè)與思考 1．將血細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果填入下表。 （二）內(nèi)容： 1．牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制。 3H MgS04 三、操作步驟 (一 )牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基。蛋白胨極易吸潮，故稱量時(shí)要迅速。若偏堿，則用 1mol／ L HCL進(jìn)行調(diào)節(jié)。但是供一般使用的培養(yǎng)基，這步可省略。分裝入三角瓶?jī)?nèi)以不超過(guò)其容積的一半為宜。要使棉塞總長(zhǎng)約 3／ 5塞入試管口或瓶口內(nèi)，以防棉塞脫落。若培養(yǎng)基分裝于試管中， 則應(yīng)先把試管扎成捆后，再于棉塞外包一層牛皮紙。 9．?dāng)[斜面 滅菌后，如制斜面，則需趁熱將試管口端擱在一根長(zhǎng)木條上，并調(diào)整斜度，使斜面的長(zhǎng)度不超過(guò)試管總長(zhǎng)的 1／ 2。其配方如下： 可溶性淀粉 20g， KN031g， ， K2HP04 1．稱量和溶解 先計(jì)算后稱量，按用量先稱取可溶性淀粉，放入小燒杯中，并用少量冷水將其調(diào)成糊狀，再加至少于所需水量的沸水中，繼續(xù)加熱，邊加熱邊攪拌，至其 15 完全溶解。 7H20，配成濃度為 ／ mL 的貯