【正文】 水產(chǎn)生物綜合實(shí)驗(yàn)指導(dǎo) 尹 玲 劉 群 編著 日照職業(yè)技術(shù)學(xué)院水產(chǎn)系 1 第一部分 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn) 1 顯微鏡的結(jié)構(gòu)和使用 一、目的與內(nèi)容 （一）目的： 初步了解顯微鏡的基本構(gòu)造，能夠規(guī)范和較熟練地使用。 （二）內(nèi)容： 顯微鏡的各部分構(gòu)造，并理解其基本性能。 通過觀察裝片，掌握顯微鏡的使用方法。 二、材料與用品 材料 生物玻片標(biāo)本。 用品 顯微鏡、擦鏡紙。 三、操作與觀察 （一）顯微鏡的構(gòu)造 普通光學(xué)顯微鏡是由機(jī)械系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)及光源系統(tǒng) 3 部分組成。此處以介紹雙筒顯微鏡為 主（圖 1－ 1）。 圖 1— 1 光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造 2 1．機(jī)械系統(tǒng) 主要對(duì)光學(xué)系統(tǒng)和光源系統(tǒng)起支持和調(diào)節(jié)作用。它包括： （ 1）鏡座與鏡柱 鏡座是顯微鏡底部的承重部分，可降低顯微鏡重心，使之不致傾倒。其后方有一直立的短柱稱為鏡柱，它支持著鏡臺(tái)。 （ 2）鏡臂與鏡筒 鏡臂是鏡柱以上的一個(gè)斜柄，便于手把握。鏡臂的頂端安裝有鏡筒和鏡頭轉(zhuǎn)換器。鏡筒是鏡臂前端的兩個(gè)圓筒，其內(nèi)安裝目鏡鏡頭。由物鏡到目鏡的光線便由此通過。調(diào)節(jié)左右鏡筒之間的水平距離，以適應(yīng)觀察者兩眼的眼間距，可使左右目鏡的視野 完全重合。 （ 3）鏡臺(tái)與標(biāo)本移動(dòng)器 鏡臺(tái)亦稱載物臺(tái)，是放置玻片標(biāo)本的平臺(tái)。其中央有一圓孔，稱通光孔，來自下方的光線可由此進(jìn)入物鏡。鏡臺(tái)上裝有標(biāo)本移動(dòng)器（或稱推進(jìn)尺），標(biāo)本移動(dòng)器上的壓片夾用以固定載玻片，鏡臺(tái)右下方有標(biāo)本移動(dòng)器調(diào)節(jié)螺旋，轉(zhuǎn)動(dòng)螺旋可前后左右移動(dòng)玻片標(biāo)本。標(biāo)本移動(dòng)器上還帶有標(biāo)尺，可利用標(biāo)尺上的刻度尋找和記錄所觀察標(biāo)本的位置。 （ 4）鏡頭轉(zhuǎn)換器 是鏡筒下端一個(gè)可旋轉(zhuǎn)的圓盤，其上可裝置數(shù)個(gè)物鏡鏡頭，轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)換器可換用不同倍數(shù)的物鏡。 （ 5）調(diào)焦螺旋 位于鏡柱的左右兩側(cè)，有粗、細(xì)兩個(gè)調(diào)焦螺旋，能使鏡 臺(tái)升降，以調(diào)節(jié)物鏡與所觀察標(biāo)本之間的距離，獲得清晰的圖像。粗、細(xì)調(diào)焦螺旋組合在一起，外周粗的螺旋為粗調(diào)焦螺旋，其升降距離較大，主要用于尋找目的物。用低倍鏡觀察標(biāo)本時(shí)，用粗調(diào)焦螺旋調(diào)焦距。粗調(diào)焦螺旋中央、周徑較小的是細(xì)調(diào)焦螺旋，其升降距離較小，能精確地對(duì)準(zhǔn)焦點(diǎn)，獲得更清晰的物像。 2．光學(xué)系統(tǒng) 亦即成像系統(tǒng)，分別由目鏡和物鏡構(gòu)成。 （ 1）目鏡 安裝在鏡筒上端，其結(jié)構(gòu)是在一個(gè)金屬圓筒上端裝有一塊較小的透鏡、下端內(nèi)側(cè)裝有一塊較大的透鏡，其作用是將物鏡所放大了的物像進(jìn)行再放大。每臺(tái)顯微鏡常備有幾個(gè)倍數(shù)不同的目鏡， 每個(gè)目鏡上分別標(biāo)有 等放大倍數(shù)。 （ 2）物鏡 由數(shù)組透鏡組成，可放大物體。透鏡的直徑越小，放大的倍數(shù)越高，每臺(tái)顯微鏡均備有幾個(gè)倍數(shù)不同的物鏡，放大 40以下的為低倍鏡，一般有 10；放大 40以上的為高倍鏡，放大 100以上的為油鏡?！?如何計(jì)算顯微鏡的放大倍數(shù)？物鏡是顯微鏡獲得物像的主要部件，其作用為聚集來自光源的光線和利用入射光對(duì)被觀察的物體做第一次放大。 3．光源系統(tǒng) 由光源、聚光器和可變光闌構(gòu)成。 （ 1）內(nèi)光源或反光鏡 在通光孔正下方的鏡座上有一個(gè)內(nèi)置式電光源，鏡座的后 側(cè) 3 有電源開關(guān)，左側(cè)或右側(cè)有光量調(diào)節(jié)器，用以調(diào)節(jié)光線的強(qiáng)弱。舊式顯微鏡采用外光源，在鏡臺(tái)孔正下方的鏡座上有一反光鏡，它為一圓形的平、凹雙面鏡，接受外來光線并將光線反射到聚光器。平面鏡反光較弱，用于光線較強(qiáng)的情況；凹面鏡反光較強(qiáng)，用于光線較弱的情況。反光鏡的方向可以任意轉(zhuǎn)動(dòng)調(diào)節(jié)，以選擇適合的角度收集來自任何方向的光線。 （ 2）聚光器 在通光孔下方，由 2— 3 塊凸透鏡組成。作用是聚集來自下方的光線，使光線增強(qiáng)，通過通光孔射入標(biāo)本上，并使整個(gè)物鏡的視野均勻受光，以提高物鏡的分辨力。 （ 3）可變光闌 位于聚光器下面 ，由許多金屬片組成。推動(dòng)操縱光圈的調(diào)節(jié)桿，就可調(diào)節(jié)光圈的大小，使上行的光線強(qiáng)弱適宜，便于觀察。 （二）顯微鏡的使用方法 （ 1）安放顯微鏡 打開鏡箱，右手緊握鏡臂，左手平托鏡座，輕放桌上距離桌子邊緣幾厘米處，讓目鏡對(duì)著觀察者。 （ 2）檢查 檢查各部件是否完好，鏡身、鏡頭必須清潔。 （ 3）對(duì)光 配置內(nèi)置式電光源的顯微鏡可直接打開電源開關(guān)，并調(diào)節(jié)光量，使視野內(nèi)的亮度達(dá)到明暗適宜，同時(shí)打開光圈。舊式顯微鏡應(yīng)首先將可變光闌的孔徑調(diào)至最大，將聚光器升至最高點(diǎn)，再將低倍鏡對(duì)準(zhǔn)通光孔，鏡頭離載物臺(tái)約 1cm。這時(shí)，把反 光鏡轉(zhuǎn)向光源，直到視野中的光線既明亮又均勻時(shí)為止。在鏡檢全過程中，根據(jù)所需光線的強(qiáng)弱，還可通過擴(kuò)大或縮小光圈、升降聚光器加以調(diào)節(jié)。 （ 4）調(diào)焦 光線對(duì)好后，將玻片標(biāo)本放在鏡臺(tái)上，有蓋玻片的一面朝上，被檢物體對(duì)準(zhǔn)鏡臺(tái)孔正中，用標(biāo)本移動(dòng)器上的壓片夾卡緊，然后調(diào)焦。轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)焦螺旋調(diào)節(jié)鏡臺(tái)與物鏡間的距離，從側(cè)面注視，以二者間距離 5mm為度。然后自目鏡觀察，慢慢轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)焦螺旋，同時(shí)移動(dòng)標(biāo)本移動(dòng)器，直到基本看清標(biāo)本物像。 （ 5）低倍鏡觀察 用粗調(diào)焦螺旋調(diào)焦后，再輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)調(diào)焦螺旋，以便得到清晰的物像。如果觀察的目標(biāo) 不在視野中央，可調(diào)節(jié)標(biāo)本移動(dòng)器，使之恰好位于視野中央?！锊Ｆ苿?dòng)方向與物像移動(dòng)方向的關(guān)系如何？ 若光線不適，可撥動(dòng)可變光闌的操縱桿，調(diào)節(jié)光線至適宜。 （ 6）高倍鏡觀察 在低倍鏡下將欲詳細(xì)觀察的標(biāo)本部分移至視野中央，再轉(zhuǎn)動(dòng)鏡頭轉(zhuǎn)換器，將高倍物鏡轉(zhuǎn)至工作位置。適當(dāng)調(diào)節(jié)亮度后，只需微微轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)調(diào)焦螺旋，就可看到更清晰的物像。★ 此時(shí)能使用粗調(diào)焦螺旋嗎？為什么？ 由于顯微鏡下觀察的被檢物有一定厚度，故在觀察過程中必須隨時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)調(diào)焦螺旋，以了解被檢物不同光學(xué)平面的情況。 在高倍鏡下，將玻片中的被檢物按從上到下、從左到右的順 序移動(dòng)、觀察一遍，再 4 由低倍鏡轉(zhuǎn)高倍鏡反復(fù)觀察幾次，以熟練高倍鏡的使用。 用高倍鏡觀察后，若有必要，可再換用油鏡觀察。 （ 7）油鏡觀察 轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)焦螺旋，使物鏡與鏡臺(tái)保持一定距離。滴 1滴香柏油于玻片標(biāo)本待觀察的區(qū)域上，將油鏡頭轉(zhuǎn)至工作位置，眼睛從側(cè)面注視，轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)焦螺旋，直至油鏡頭浸沒于香柏油內(nèi)，幾乎與載玻片相接觸，但不能相碰。然后從目鏡中觀察，用粗調(diào)焦螺旋極其緩慢地向上調(diào)節(jié)至出現(xiàn)物像為止，★ 注意勿將粗調(diào)焦螺旋轉(zhuǎn)動(dòng)方向搞反了，以免油鏡頭與載玻片相碰而損壞了鏡頭及玻片。 再用細(xì)調(diào)焦螺旋調(diào)至物像清晰，此時(shí)還應(yīng)適當(dāng)增 加光的亮度。如果鏡頭已提出香柏油而尚未見到物像時(shí)，應(yīng)按上述過程重復(fù)操作。使用完畢，將鏡頭從香柏油中脫離，取下玻片，用擦鏡紙擦去鏡頭和玻片上的香柏油，再用擦鏡紙蘸少許二甲苯擦拭鏡頭上的油跡，然后用干凈擦鏡紙擦去鏡頭上殘留的二甲苯。二甲苯用量不宜過多，擦試時(shí)間應(yīng)短?！?切忌用手或其他紙擦試鏡頭，以免損壞透鏡。 （ 8）復(fù)原 顯微鏡使用完畢，關(guān)閉電源，將物鏡鏡頭轉(zhuǎn)開，取下玻片。擦凈載物臺(tái)和物鏡，將各部分還原，★ 注意物鏡頭不可正對(duì)通光孔，裝鏡入箱。 四、作業(yè)與思考 1．總結(jié)使用顯微鏡應(yīng)特別注意的幾個(gè)問題。 2．總結(jié)自 己第一次使用顯微鏡的優(yōu)缺點(diǎn)。 3．由低倍鏡轉(zhuǎn)到高倍鏡應(yīng)注意哪些問題。 5 實(shí)驗(yàn) 2 細(xì)胞的制片與觀察和細(xì)胞大小的測(cè)量 一、目的與內(nèi)容 （一）目的 1．學(xué)習(xí)動(dòng)物細(xì)胞標(biāo)本的涂片制作法和了解動(dòng)物細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)。 2．學(xué)習(xí)并掌握測(cè)量細(xì)胞大小的基本方法。 （二）內(nèi)容 1．制備口腔粘膜細(xì)胞標(biāo)本、觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及線粒體的活性染色顯示。 2．細(xì)胞中 DNA和 RNA的顯示。 3．利用顯微鏡測(cè)微技術(shù)測(cè)量大鼠肝細(xì)胞及其細(xì)胞核直徑。 二、材料與用品 （一）材料 人口腔粘膜細(xì)胞、大鼠。 （二）用品 顯微鏡、 鏡臺(tái)測(cè)微尺、目鏡測(cè)微尺、無菌牙簽、解剖器具、染色缸、染色架、載玻片、蓋玻片、滴管、吸水紙。 ％生理鹽水、 mol／ L 碘液、 ％詹納斯綠 B、醋酸洋紅染液、甲基綠 派洛寧染液、卡諾氏固定液、丙酮、二甲苯、中性樹膠、蒸餾水、水。 三、操作與觀察 （一）人口腔粘膜上皮細(xì)胞的制備與觀察 1．滴 1 滴 ％生理鹽水于載玻片中央，用無菌牙簽粗的一端輕輕地在口腔頰部刮幾下，將刮下的白色粘性物質(zhì)放入載玻片上的滴液內(nèi)，輕輕涂抹使分散均勻；用鑷子夾住一塊潔凈的蓋玻片的一邊，使另一邊與載玻片上的滴液邊緣接觸，然后 緩慢放下，防止產(chǎn)生氣泡，用吸水紙從蓋玻片邊緣吸去多余的液體。 2．置低倍鏡下尋找輪廓較清楚的單個(gè)細(xì)胞并移至視野中央，再轉(zhuǎn)高倍鏡觀察。可見口腔粘膜上皮細(xì)胞呈扁平多邊形或扁圓形，仔細(xì)辨認(rèn)細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜等基本結(jié)構(gòu)。觀察時(shí)光線應(yīng)暗些。★ 為什么？ 3．如細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察不夠清楚，可在蓋玻片一側(cè)滴 1 滴 mol／ L 碘液（也可采用％亞甲基藍(lán)或 ％中性紅染液），在蓋玻片另一側(cè)用吸水紙吸引，使碘液通過細(xì)胞進(jìn)行染色，再置顯微鏡下觀察，細(xì)胞質(zhì)染成淺黃色，而細(xì)胞核染成深黃色。 6 （二）口腔粘膜細(xì)胞活體染色顯示線 粒體 將從口腔粘膜刮下的白色粘性物薄而均勻地涂在載玻片上，加一滴 ％詹納斯綠 B染液，染色 20min，蓋上蓋玻片，置顯微鏡下觀察，高倍鏡下可見細(xì)胞質(zhì)無色，在細(xì)胞質(zhì)中散在一些藍(lán)綠色短桿狀和圓形顆粒，即為線粒體。★如果整個(gè)細(xì)胞全為藍(lán)色，說明什么 ? 1．取材 用手捏住大鼠的頭部，剪斷其頸部動(dòng)脈，放血致死。用自來水沖洗大鼠頸部血跡和腹部，于蠟盤中用大頭針固定四肢，打開腹腔，迅速取出肝臟，剪成 1～ 2mm厚的小塊（★ 注意安全，此步驟由教師完成 ）。 2．涂片 取一小塊肝臟，在一干凈的載玻片中央涂抹數(shù)下。 3．固定 浸入卡諾氏固定液中固定 5— 10min。 4．染色 將涂片平放在染色架上，在標(biāo)本上滴數(shù)滴甲基綠 — 派洛寧染液，染色 20min。 5．水洗和分色 用蒸餾水緩緩沖去玻片上多余的染液，并用吸水紙吸去多余水分，但不可吸得過干，再用丙酮滴在標(biāo)本上分色 30s，隨后放入丙酮 — 二甲苯（ 1： 1）溶液中浸泡片刻。 6．透明和封片 將涂片放入二甲苯中 10min，取出，滴 1 滴中性樹膠，蓋上蓋玻片（方法同前）。 7．觀察 置顯微鏡下觀察，其中含 RNA區(qū)域被染成紅色，而含 DNA區(qū)域被染成藍(lán)綠色或淡綠色，注意 RNA、 DNA在細(xì)胞 中的分布區(qū)域。 （三）細(xì)胞大小的測(cè)量 1．顯微測(cè)微尺及其使用方法 （ 1）顯微測(cè)微尺由鏡臺(tái)測(cè)微尺（臺(tái)尺）和目鏡測(cè)微尺（目尺）組成。臺(tái)尺是一特制的載玻片，其中央具有精確刻度的標(biāo)尺，專門用于校正目尺每格長(zhǎng)度，標(biāo)尺全長(zhǎng) 1 mm，等分為 10大格，每大格再等分為 10小格，所以每小格長(zhǎng) mm，即 10pm。亦有全長(zhǎng)為， 2 mm，共等分為 200 小格，每小格長(zhǎng)度不變。目尺是一個(gè)可以放入目鏡內(nèi)的特制圓形玻片，在中央刻有不同形式的標(biāo)尺，多為直線式，長(zhǎng) 5mm，等分為 5大格、 50小格。目尺每格測(cè)量的實(shí)際長(zhǎng)度因不同物鏡的放大 倍數(shù)和不同顯微鏡鏡筒長(zhǎng)度的差異而有所不同，因此在使用前需用臺(tái)尺校正。 （ 2）目尺的校正（標(biāo)定） ①自鏡筒中取下一枚目鏡，卸下目鏡上的透鏡，將目尺裝入目鏡的光闌板上，有刻度的一面向下，再將目鏡上的透鏡旋上，并將目鏡放回鏡筒。 ②將臺(tái)尺置于載物臺(tái)上，有刻度的一面朝上。 ③在低倍鏡下將臺(tái)尺 (標(biāo)尺外圍有一小黑環(huán) )移至視野中央，然后換用測(cè)量時(shí)所用放大倍數(shù)的物鏡，調(diào)焦，使標(biāo)尺上的刻度清晰可見。 7 ④轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡，使目尺的刻度與臺(tái)尺的刻度平行，再移動(dòng)標(biāo)本移動(dòng)器，使目尺的零線與臺(tái)尺某段的刻度線相重合，然后找出兩尺的第 2 條重合線（圖 2— 1），準(zhǔn)確讀出并記錄兩重合線之間目尺和臺(tái)尺各有多少格。 ⑤計(jì)算目尺每小格所測(cè)量的鏡臺(tái)上物體的實(shí)際長(zhǎng)度。 目尺每小格實(shí)際測(cè)量長(zhǎng)度（μ m）＝（ 2條重合線間臺(tái)尺的格數(shù) 10） /2 條重合線間目尺的格數(shù)?！?如果換用不同倍數(shù)的目鏡或物鏡，此數(shù)據(jù)能否采用？為什么？ （ 3）細(xì)胞體積、核體積和核質(zhì)比的計(jì)算公式： 圖 21 用鏡臺(tái)測(cè)微尺校正目鏡測(cè)微尺 橢圓形 V＝ 234 ab? (a、 b 為長(zhǎng)、短半徑） 圓球形 V＝ 334R? （ R 為半 徑） 核質(zhì)比 NP＝ Vn／ (Vc－ Vn）（ Vn為核的體積， Vc為細(xì)胞的體積） 2．大鼠肝細(xì)胞大小的測(cè)定 （ 1）染色 取一涂有肝細(xì)胞的載玻片，浸入卡諾氏固定液中固定 5－ 10min 滴 1 滴醋酸洋紅染液，蓋上蓋玻片，置顯微鏡下觀察，細(xì)胞核呈鮮紅色，細(xì)胞質(zhì)呈淺紅色。 （ 2）測(cè)量 目尺校正好后，移去臺(tái)尺，換上已染色的肝細(xì)胞涂片，隨機(jī)挑選 20 個(gè)形態(tài)較規(guī)則的細(xì)胞用目尺測(cè)量其占幾小格，再乘以目尺每小格實(shí)際測(cè)量長(zhǎng)度，即為細(xì)胞直徑。同法測(cè)量相應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞核直徑，記錄數(shù)據(jù)。 （ 3）數(shù)據(jù)處理 由細(xì)胞直徑和細(xì)胞核直徑計(jì)算出各細(xì) 胞及其細(xì)胞核的體積，算出各細(xì)胞的核質(zhì)比。并計(jì)算細(xì)胞直徑、細(xì)胞核直徑及核質(zhì)比的平均值。 *為什么要測(cè)量 20 個(gè)細(xì)胞的數(shù)據(jù)，再計(jì)算平均值 ? 四、作業(yè)與思考 1．繪人口腔粘膜上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)圖，并注明各部分名稱。 2．列表記錄所測(cè)量的各細(xì)胞直徑和細(xì)胞核直徑，計(jì)算出其細(xì)胞體積和核質(zhì)比，以及其平均值。 8 實(shí)驗(yàn) 3 血細(xì)胞的數(shù)量測(cè)定與血型鑒定