病毒性傳染病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)進(jìn)展(文件)
【正文】 導(dǎo)則 48 靶序列來源 : a. 單抗檢出的 TB抗原蛋白編碼基因 b. TB特異性核酸片段克隆 c. 插入序列 結(jié)核分枝桿菌 (TB) 的分子診斷 TB 檢測(cè) ?實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)特點(diǎn) 49 65KD， 165bp。 HCV基因分型常選用的區(qū)域 丙型肝炎的分子診斷 44 臨床工作 ? 目前常用的基因型檢測(cè)方法（ RFLP, InnoLipa, Trugene) 通常建立在 5’非編碼區(qū)，因?yàn)樵搮^(qū)序列保守，檢測(cè)靈敏度高，是 HCV RNA診斷實(shí)驗(yàn)的常用區(qū)域。ayw3。adrq+。 55℃ 左右 19 PCR 循環(huán) 第三步 引物延伸 在 DNA聚合酶催化作用下，以 dNTPs為原料（底物），從引物的 3’端 A開始 , 沿著 5’ →3 ’的方向，合成每條模板的互補(bǔ)鏈，此稱引物延伸。C 靶序列引物退火 55 176。 ? 線性探針分析法（ LiPA） ? 雜交保護(hù)分析法（ HPA） 質(zhì)譜 ? 利用色、質(zhì)譜結(jié)合 PCR技術(shù) 6 分子診斷的功能及擴(kuò)展 ? 病原的診斷和鑒別診斷 ? 病原分型 ? 病毒載量監(jiān)測(cè) 個(gè)體化治療的依據(jù) ? 療效及預(yù)后標(biāo)志 ? 其他：病原感染中發(fā)生、發(fā)展各階段 7 分子診斷的功能及擴(kuò)展 ? 疾病分型及意義 例如： HPV （ 30/100） 高危 16， 18， 31， 45 低危 6， 11 8 分子診斷的功能及擴(kuò)展 ? 病毒載量與治療 例 1. 北京地壇醫(yī)院謝堯提供 9 分子診斷的功能及擴(kuò)展 ? 病毒載量與治療 例 2. HBV干擾素 HBV100pg/mL 11/30 陰轉(zhuǎn) HBV100pg/mL 1/30 陰轉(zhuǎn) (HBeAg ?HBeAb) 10 分子診斷的功能及擴(kuò)展 ? 病毒載量與治療 例 3. HIV病毒載量與傳播 15127人 流行病學(xué)調(diào)查 415對(duì)伴侶 30個(gè)月 HIV陽轉(zhuǎn) 22%（ 90/415） 51人 RNA1500copies/mL 全陰 11 分子診斷的功能及擴(kuò)展 ? 病毒載量與治療 例 4. 血漿 EBV載量與鼻咽癌復(fù)發(fā) 15個(gè)二年持續(xù)緩解： 0 copy/mL 10個(gè)復(fù)發(fā)： 32250 copies/mL 17個(gè)隨訪：臨床惡化前半年病毒載量升高 12 耐藥病原的分子診斷 ? WHO：人類死亡 1/3是長(zhǎng)期用藥的毒副作用 ? HBV的 YMDD變異 ? HIV耐藥 13 血制品篩查 ? 300余萬的血清陰性樣品，分子生物學(xué)復(fù)測(cè)： HBV： 47 HCV： 10 HIV1： 2 2023年劍橋資料 ? HIV1血清陰性而 RNA陽性 % Am. J. Chin Athol. 2023 14 ?在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域中的應(yīng)用； ?遺傳病的基因診斷和產(chǎn)前基因診斷： 如血友病、地中海貧血等 ?腫瘤基因和腫瘤標(biāo)志物表達(dá) (mRNA)的檢測(cè)； ?骨髓移植、器官移植供體配型選擇； ?法醫(yī)學(xué)、動(dòng)植物學(xué)、古人類學(xué)、古生物學(xué)； ?與疾病相關(guān)的各種蛋白（細(xì)胞因子、酶、激素、受體）的基因表達(dá)的檢測(cè)； ?藥物基因組學(xué)、耐藥基因的檢測(cè)，等等 分子生物學(xué)技術(shù)在其它領(lǐng)域的應(yīng)用 15 簡(jiǎn)單介紹實(shí)驗(yàn)原理 ? PCR (Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈反應(yīng) ) ? 熒光實(shí)時(shí)定量 PCR （ real time PCR） ? NASBA （依賴核酸序列的擴(kuò)增） 16 PCR原理 :實(shí)質(zhì)就是 體外基因復(fù)制技術(shù) Mg2+ dCTP dGTP dUTP dATP Taq DNA聚合酶 AmpErase Primer 靶序列 加熱變性 95 176。 18 PCR 循環(huán) 第二步 – 引物與靶序列退火 引物與解為單鏈的 DNA上互補(bǔ)序列雜交在一起，稱之為退火。 ? 定性 PCR測(cè)定的是擴(kuò)增的終點(diǎn)（平臺(tái)期） 定量 PCR與定性 PCR測(cè)定的區(qū)別 25 市場(chǎng)上常見的實(shí)時(shí)熒光 PCR儀 羅氏 Lightcycler MJ opticon2 伯樂 icycler ABI7000 杭州博日（原大和） linegene 26 NASBA擴(kuò)增原理 引物 1 逆轉(zhuǎn)錄酶 RNase H 引物 2 逆轉(zhuǎn)錄酶 T7 RNA 聚合 酶 引物 2 逆轉(zhuǎn)錄酶 逆轉(zhuǎn)錄酶 RNase H 引物 1 線性循環(huán) 擴(kuò)增循環(huán) 28 NASBA 和 PCR 的不同
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