【正文】 通常采用低劑量、長時間處理。 新誘變因子及誘變技術(shù)進展 ? 低能離子束誘變： 是利用 離子注入設(shè)備 產(chǎn)生離子束 (40~60keV)并注入生物體引起遺傳物質(zhì)的永久改變 ,然后從變異菌株中選育優(yōu)良菌株的方法。 篩選方法 ? 平皿快速檢測法 ? 形態(tài)變異的利用 ? 高通量篩選 平皿快速檢測法 A、紙片培養(yǎng)顯色法 :浸有指示劑濾紙 B、變色圈法 :直接用顯色劑或指示劑 C、透明圈法 :混濁底物被分解后形成透明圈。通過接合而獲得新遺傳性狀的受體細胞，就是 接合子 （ conjugant） 。 霉菌的雜交育種：有性生殖、準性生殖 ? 準性生殖是一種類似于有性生殖，但比它更為原始 的一種兩性生殖方式，這是一種在同種而不同菌株的 體細胞間 發(fā)生融合，它可不借減數(shù)分裂而導致低頻率基因重組并產(chǎn)生重組子。 3）核融合 (nuclear fusion)： 異核體中的雙核偶爾可以發(fā)生核融合，產(chǎn)生雙倍體雜合子核。 選擇兩個有特殊價值的并帶有選擇性遺傳標記的細胞作為親本 脫壁酶 細菌或放線菌可用 溶菌酶 或 青霉素 處理， 真菌可用 蝸牛酶 或其他相應的 脫壁酶 等 離心聚集 在高滲溶液中稀釋 加入促融合劑或電脈沖 各種選擇性培養(yǎng)基 原生質(zhì)體融合的主要步驟是： 基于代謝調(diào)節(jié)的育種技術(shù) ? 代謝工程育種（第三代基因工程）：通過特定突變型的選育，達到改變代謝通路，降低支路代謝終產(chǎn)物的生產(chǎn)或切斷支路代謝途徑及提高細胞膜透性，使代謝流向目標產(chǎn)物積累的方向發(fā)展。 抗分解調(diào)節(jié)突變株的選育 ：抗分解阻遏和抗分解抑制的突變?？狗答佂蛔冃秃涂棺瓒敉蛔冃?。 ? 蛋白質(zhì)工程分為理性設(shè)計（定點改造、定向改造）和非理性的體外定向進化（隨機化突變、定向篩選） 定點突變技術(shù) ? 定點突變技術(shù)是基于蛋白質(zhì)工程的理論，以蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的計算機預測為基礎(chǔ)，設(shè)計新蛋白質(zhì)的氨基酸序列，應用重組 DNA技術(shù)設(shè)計并構(gòu)建具有新性質(zhì)的蛋白質(zhì)或酶的過程。 代謝工程育種思路 1. 改變代謝流： 改變分支代謝途徑的流向，阻斷有害代謝產(chǎn)物的合成。 3. 轉(zhuǎn)移或構(gòu)建新的代謝途徑 1)轉(zhuǎn)移代謝途徑 : 為生產(chǎn)某一新的化學結(jié)構(gòu)的代謝產(chǎn)物 ， 將催化某一代謝途徑的基因組克隆到另一不具備該種能力的微生物中 ， 達到代謝途徑轉(zhuǎn)移的目的 ， 使之具備生產(chǎn)該種新化合物的能力 。（圖 29） 反向生物工程育種 ? 反向代謝工程針對限制生物活性的主要因素，在相關(guān)生物種類識別希望的表型，確定該表型的決定基因，通過重組 DNA技術(shù)將該基因在需改造的生物中克隆表達出來。 ? 代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力下降：如藤倉赤霉產(chǎn)赤霉素能力下降； 退化的原因 1）基因突變 那些控制生產(chǎn)性狀的基因發(fā)生負突變。 4）利用不易衰退的細胞傳代 在放線菌和霉菌中，由于其菌絲細胞常含有幾個細胞核，若用菌絲接種就易出現(xiàn)衰退，而孢子一般是單核的，用于接種，就不會發(fā)生這類現(xiàn)象。 選擇合適的培養(yǎng)條件 如平菇菌種在 PDA培養(yǎng)基上連續(xù)傳代會導致菌種衰退，而在 PDA綜合培養(yǎng)基（ PDA中添加維生素和蛋白胨等）中培養(yǎng)則能使衰退的菌種復壯。 2．穿刺保藏法：常用于保藏各種需氣性細菌。 4．冷凍干燥保藏法： 其基本原理是將微生物或孢子冷凍，然后在減壓的情況下使水分升華，使細胞的代謝、生理等生命活動處在停止狀態(tài)下長期保藏。 （四）、國內(nèi)外菌種保藏機構(gòu) 我國的主要微生物菌種保藏機構(gòu) 1） 普通微生物菌種保藏管理中心 中國科學院微生物研究所 、 中國科學院武漢病毒研究所 2） 農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心 中國農(nóng)科院土壤肥料研究所 3）工業(yè)微生物菌種保藏管理中心 食品發(fā)酵工業(yè)科學研究院 4） 醫(yī)學微生物菌種保藏管理中心 中國醫(yī)學科學院皮膚研究所 、 衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所 、 中國醫(yī)學科學院病毒研究所 5） 抗生素菌種保藏管理中心 中國醫(yī)學科學院抗生素研究所 、 四川抗生素工業(yè)研究院 、 華北藥廠抗生素研究所 6）獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心 農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)藥品監(jiān)察所 國外主要的微生物菌種保藏機構(gòu) 1） 美國標準菌種收藏所 ATCC 2） 美國冷泉港研究室 CSH 3） 日本東京大學應用微生物研究所 IAM 4）日本大阪發(fā)酵研究所 IFO 5） 日本東京科研化學有限公司 KCC 6） 英國國立標準菌種收藏所 NCTC 7） 美國國立衛(wèi)生研究所 NIH 8） 美國農(nóng)業(yè)部北方開發(fā)利用研究部 NRRL 。 6．低溫保藏法：大多數(shù)微生物可在 20℃ 以下的低溫中保藏。 3．沙土管干燥保藏法： 這種方法適用于形成芽孢的細菌、形成孢子的絲狀真菌和放線菌。 ?菌種保藏的基本原理： 根據(jù)微生物的生理生化特性，人為地創(chuàng)造條件，使微生物處于代謝不活潑、生長繁殖受到抑制的休眠狀態(tài)，以減少菌種的變異。 5）采用有效的菌種保藏方法 純種分離法 在衰退菌種的細胞群中，一般還存在仍保持原有性狀的個體，設(shè)法對其進行分離純化。 2） 控制傳代次數(shù) 如產(chǎn)腺苷的芽孢桿菌黃嘌呤營養(yǎng)缺陷型菌株，回復子的比例隨傳代次數(shù)的增加而增加，腺苷產(chǎn)量也隨之下降。 第四節(jié) 發(fā)酵工業(yè)菌種保藏 工業(yè)生產(chǎn)菌種的退化現(xiàn)象及原因 菌種退化 （ degeneration） 主要指生產(chǎn)菌種或選育過程中篩選出來的優(yōu)良菌株 ， 由于連續(xù)傳代或保藏之后 ， 群體中某些生理和形態(tài)特征逐漸退化或完全喪失 （ 包括菌株產(chǎn)孢子能力 、發(fā)酵主產(chǎn)物產(chǎn)量下降 ） 的現(xiàn)象 。 組合生物合成育種 ? 通過合成化合物庫進行高效率的篩選。 （ 3）構(gòu)建代謝旁路 （ 4）改變能量代謝途徑 2. 擴展代謝途徑 （ 1） 在引入外源基因后 ， 使原來的代謝途徑向后延伸 ， 產(chǎn)生新的末端代謝產(chǎn)物 。 ? 特點：依賴基因隨機突變，建立突變體文庫 ? 方法：易錯 PCR； DNA隨機重組（圖 28） 代謝工程的定義 ? 利用多基因重組技術(shù)有目的地對細胞代謝途徑進行修飾、改造，改變細胞特性，并與細胞基因調(diào)控、代謝調(diào)控及生化工程相結(jié)合，為實現(xiàn)構(gòu)建新的代謝途徑，生產(chǎn)特定目的產(chǎn)物而發(fā)展起來的一個新的學科領(lǐng)域。 ? 它是現(xiàn)代生物技術(shù)的一個重要組成方面，在工業(yè)微生物學上提供了巨大的創(chuàng)造具有工業(yè)應用價值的生產(chǎn)菌株的潛力。 營養(yǎng)缺陷型在代謝調(diào)節(jié)育種中的應用 ：使發(fā)生障礙前一步的中間代謝產(chǎn)物積累。 ? 限量誘導物恒化培養(yǎng) ：誘變后接到低濃度的誘導物的恒化器中連續(xù)培養(yǎng)。 原生質(zhì)體融合 ? 使遺傳性狀不同的兩細胞的原生質(zhì)體發(fā)生融合，并發(fā)生遺傳重組以產(chǎn)生融合子（ fusant）的過程。頻率極低。方法上類似霉菌。 D、生長圈法 :利用某些具有特殊營養(yǎng)要求的微生物作為工具菌 E、抑制圈法 在瓊脂平板上，通過觀察測定某突變菌落周圍 蛋白酶水解圈 的大小、 淀粉酶變色圈 （用碘液使淀粉顯色）的大小， 氨基酸顯色圈 （將菌落用打孔機取下，轉(zhuǎn)移