【正文】 多，更會(huì)誤認(rèn)為微生物之增殖，但以培養(yǎng)細(xì)菌之培養(yǎng)基檢測(cè)，又沒(méi)有污染。以不加血清之a(chǎn)MEM 稀釋細(xì)胞濃度為1102活細(xì)胞數(shù)/ ml。 5. 去除培養(yǎng)基，加入1 ml Carnoy’s 固定液(甲醇:冰醋酸﹦ 3:1)，室溫下靜置10 min。 9. 以肉眼計(jì)數(shù)群落數(shù) 10. 計(jì)算SPE ( Serum Plating Efficiency )： SPE = ( no. of colonies / well ) / 100 x 100 % 11. 計(jì)算RPE(Relative Plating Efficiency)： SPE = [ total colonies of six well (test) / Total colonies of six well (control) ] x100 % 比較各濃度血清培養(yǎng)基之RPE，即可得知待測(cè)血清對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。 . 用DPBS 洗滌細(xì)胞一至二次。. 懸浮型細(xì)胞(suspension cell) . 吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，放入離心管中，離心1000 rpm 5 分鐘。若體積太大，可傾斜放置，或分殖至新培養(yǎng)瓶中。DMSO 應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí)，無(wú)菌且無(wú)色( micronFGLP Telflon 過(guò)濾或是直接購(gòu)買無(wú)菌產(chǎn)品，如Sigma D2650)，以5~10 ml 小體積分裝，4℃避光保存，勿作多次解凍。 . adherent tumor lines: 5~7 x 106，依細(xì)胞種類而異。. 冷凍方法： . 傳統(tǒng)方法: 4℃ 10 分鐘 20℃ 30 分鐘 80℃ 16 18 小時(shí)(或隔夜) 液氮槽vapor phase 長(zhǎng)期儲(chǔ)存。 . 配制冷凍保存溶液(使用前配制)：將DMSO 加入新鮮培養(yǎng)基中，最后濃度為510％，混合均勻，置于室溫下待用。 . 冷凍保存方法2: 冷凍管置于已設(shè)定程序之等速降溫機(jī)中，再放入液氮槽中。 自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過(guò)程，此時(shí)蓋子易松掉。C 水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化，以70 % ethanol 擦拭保存管外部，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。惟若要立即去除，則將解凍之細(xì)胞懸浮液加入含有510 ml 培養(yǎng)基之離心管內(nèi)，離心1,000 rpm, 5 分鐘，移去上清液，加入新鮮培養(yǎng)基，混合均勻，放入CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。C， 隔夜后， 移到液氮)。. 將培養(yǎng)基置于37 176。輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化后， 以70 % ethanol 擦拭冷凍管外部， 移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。 . 對(duì)絕大多數(shù)細(xì)胞而言，1 % 以下之冷凍保護(hù)劑DMSO，不會(huì)對(duì)細(xì)胞之貼附或活化有不良影響，不需立刻由解凍細(xì)胞中去除， 待第二天確定細(xì)胞生長(zhǎng)或貼附良好后再去除即可。請(qǐng)檢查flask 外觀，并于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況和有無(wú)污染現(xiàn)象，若有任何問(wèn)題， 不要打開(kāi)蓋子，請(qǐng)立即通知細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室。隔天后，于無(wú)菌操作箱內(nèi)取出flask內(nèi)之培養(yǎng)基，(取出之培養(yǎng)基可以再使用)，僅留約510ml 培養(yǎng)基于flask 內(nèi)，依一般培養(yǎng)方式再將細(xì)胞置入培養(yǎng)箱中，或細(xì)胞已長(zhǎng)滿盤(pán)， 則將細(xì)胞做傳代培養(yǎng)。使用時(shí)，計(jì)數(shù)每個(gè)大正方形內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以104，即為每ml 中之細(xì)胞數(shù)目。 . 范例： T75 monolayer culture 制成10ml 細(xì)胞懸浮液， ml trypanC 水槽中快速解凍， 輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化， 并注意水面不可超過(guò)冷凍管蓋沿， 否則易發(fā)生污染情形。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)之細(xì)胞培養(yǎng)基， 若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基， 細(xì)胞大都無(wú)法立即適應(yīng)， 造成細(xì)胞無(wú)法存活。升級(jí)篇細(xì)胞培養(yǎng)25 何謂FBS, FCS, CS, HS ? FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 兩者都是指胎牛血清， FCS 乃錯(cuò)誤的使用字眼， 請(qǐng)不要再使用。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 g 時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用10 % CO2；當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 g 時(shí)， 則應(yīng)使用5 % CO2 培養(yǎng)細(xì)胞。第一次開(kāi)瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中， 保存于–20 176。升級(jí)篇細(xì)胞培養(yǎng)311 欲將一般動(dòng)物細(xì)胞離心下來(lái)，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？ 欲回收動(dòng)物細(xì)胞， 其離心速率一般為300xg (約1,000rpm)，5 10 分鐘， 過(guò)高之轉(zhuǎn)速， 將造成細(xì)胞死亡。 注意：由于DMSO 稀釋時(shí)會(huì)放出大量熱能， 故不可將DMSO 直接加入細(xì)胞液中， 必須使用前先行配制完成。15 冷凍保存細(xì)胞之方法？ 冷凍保存方法一: 冷凍管置于4 176。 冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降13 176。C 不可超過(guò)1 小時(shí)， 以防止冰晶過(guò)大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過(guò)此步驟直接放入80176。細(xì)胞污染的種類可分成細(xì)菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。直接滅菌后丟棄之。故進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，必須確認(rèn)細(xì)胞為mycoplasmafree，實(shí)驗(yàn)結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義。C 冰箱中， 顏色會(huì)偏暗紅色， 且pH值會(huì)越來(lái)越偏堿性？ 培養(yǎng)基保存于4 176。若培養(yǎng)基偏堿時(shí)， 可以通入無(wú)菌過(guò)濾之CO2， 以調(diào)整pH 值。26 購(gòu)買之細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活率不佳可能原因？ 研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)存活率不佳， 常見(jiàn)原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯(cuò)誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞。27 收到之冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落之原因？ 冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂，可能是因?yàn)椴僮髡邐A取冷凍管時(shí)用力不當(dāng)，造成冷凍管裂損，建議使用止血鉗小心夾取。29 L谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？ L谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)是重要的。30 GlutaMAXI是什么？培養(yǎng)細(xì)胞如何利用GlutaMAXI？這個(gè)二肽有多穩(wěn)定？ GlutaMAXI 二肽是一個(gè)L谷氨酰胺的衍生物，其不穩(wěn)定的alpha氨基用L丙氨酸來(lái)保護(hù)。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用，（特別是雌激素）。33二價(jià)離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時(shí)加入EDTA的目的是什么？ 二價(jià)離子的確抑制胰蛋白酶活性。原因是什么？Hank’s 平衡鹽溶液(HBS)和Earle‘s平衡鹽溶液(EBS)有什么本質(zhì)的功能差別？ HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Eagles ()中比在Hanks () 中高。如果僅僅是清洗將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中儲(chǔ)存的組織，用Hanks液就可以了。血清蛋白會(huì)結(jié)合和滅活一些抗生素。一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時(shí)，您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它。大部分添加物和試劑最多可以凍融3次，如果次數(shù)更多都會(huì)在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，將會(huì)影響它的性能。在溶解的一周內(nèi)使用貯存在4℃冰箱中的液體胰蛋白酶溶液。NaHCO3 緩沖系統(tǒng)緩沖力不足。（2）改用不依賴CO2 培養(yǎng)液。丟棄培養(yǎng)物或用抗生素除菌。將培養(yǎng)液加熱到37℃，搖動(dòng)使其溶解如沉淀仍然存在，丟棄培養(yǎng)液。支原體污染。清潔支架和培養(yǎng)箱。蛋白酶過(guò)度消化使得細(xì)胞裂解釋放DNA。用DNase I 處理細(xì)胞。細(xì)胞凍存或復(fù)蘇過(guò)程中損傷。注意：大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞能耐受滲透壓為260 – 350 mOsm/kg。培養(yǎng)物中有少量細(xì)菌或真菌污染。讓細(xì)胞逐漸適應(yīng)新培養(yǎng)液?；蛴每股爻?。接種細(xì)胞起始濃度太低：細(xì)胞已老化支原體污染增加接種細(xì)胞起始濃度。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。2. 如何解凍血清才不會(huì)使產(chǎn)品質(zhì)量受損?建議您將血清從冷凍箱取出后，先置于2～8℃冰箱使之融解，然后在室溫下使之全融。然而，若存放于4℃時(shí)，請(qǐng)勿超過(guò)一個(gè)月。分離培養(yǎng)物，檢測(cè)支原體。培養(yǎng)液需在2－8℃避光保存。補(bǔ)加谷氨酰胺或生長(zhǎng)因子。比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分，比較新血清與舊血清支持細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)。換入新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)減慢：由于更換不同培養(yǎng)液或血清。培養(yǎng)液種有毒代謝產(chǎn)物堆積。培養(yǎng)細(xì)胞死亡：培養(yǎng)箱內(nèi)無(wú)CO2。分離培養(yǎng)物，檢測(cè)支原體。懸浮細(xì)胞成簇：培養(yǎng)液中含鈣、鎂離子?？s短胰蛋白酶消化時(shí)間或降低胰蛋白酶濃度。或用抗生素除菌。冰凍保存培養(yǎng)液。加HEPES 緩沖液至10 到25mM 終濃度。細(xì)菌、酵母或真菌污染。細(xì)胞分離試劑（1）大部分連續(xù)細(xì)胞系，強(qiáng)貼壁細(xì)胞系，許多早代細(xì)胞：HBSS或無(wú)鈣鎂PBS％胰蛋白酶溶解在無(wú)鈣鎂平衡鹽溶液中細(xì)胞表面蛋白完整性重要的連續(xù)細(xì)胞系：HBSS或無(wú)鈣鎂PBS％ EDTA弱貼壁表皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化成纖維細(xì)胞（要求細(xì)胞表面完整性），原代細(xì)胞：HBSS或無(wú)鈣鎂PBSEDTA,甘油 溶解在檸檬酸鈉中強(qiáng)貼壁早代細(xì)胞系：HBSS或無(wú)鈣鎂PBS％胰蛋白酶溶解在1mM EDTA，Dispase 細(xì)胞分離試劑（2）上皮細(xì)胞： 1mM EDTA 1mM EDTA，Dispase 強(qiáng)貼壁細(xì)胞，上皮細(xì)胞，一些腫瘤細(xì)胞： 1mM EDTA％胰蛋白酶1mM EDTA，Dispase 厚培養(yǎng)物，多層富含膠原的密集培養(yǎng)：1mM EDTA％胰蛋白酶，200單位/ml膠原酶，1mM EDTA溶解在無(wú)鈣鎂平衡鹽溶液中培養(yǎng)液pH 值變化太快：CO2 張力不對(duì)。383736Eagles液在空氣水平的CO2中，溶液會(huì)變堿，Hanks液在CO2培養(yǎng)箱中會(huì)變酸。建議胰蛋白酶處理細(xì)胞前，用EDTA清洗細(xì)胞，以消除來(lái)自培養(yǎng)基中所有的二價(jià)離子。由于酚紅干擾檢測(cè)，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測(cè)時(shí)，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。 GlutaMAXI二肽非常穩(wěn)定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAXI 二肽溶液有最小的降解，如果在相同條件下，L谷氨酰胺幾乎完全降解。L谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后會(huì)降解，但是確切的降解率一直沒(méi)有最終定論。在MEM中培養(yǎng)的細(xì)胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長(zhǎng)。細(xì)胞置于–80 176。解凍過(guò)程錯(cuò)誤。25 購(gòu)買之細(xì)胞冷凍管經(jīng)解凍后，為何會(huì)發(fā)生細(xì)胞數(shù)目太少之情形？ 研究人員在冷凍細(xì)胞之培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目太少， 大都是因?yàn)殡x心過(guò)程操作上的失誤， 造成細(xì)胞的物理性損傷， 以及細(xì)胞流失。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會(huì)隨堿性增加而更偏暗紅。22 CO2 培養(yǎng)箱之水盤(pán)如何保持清潔？ 定期(至少每?jī)芍芤淮? 以無(wú)菌蒸餾水或無(wú)菌去離子水更換之。除極有經(jīng)驗(yàn)之專家外，大多數(shù)遭受支原體污染的細(xì)胞株，無(wú)法以其外觀分辨之。嚴(yán)格之無(wú)菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細(xì)胞來(lái)源和培養(yǎng)基配制是減低污染之最好方法。升級(jí)篇細(xì)胞培養(yǎng)416 細(xì)胞欲冷凍保存時(shí)， 細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度？ 冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為1x106 cells/ml vial， 融合瘤細(xì)胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。C 以下， 再放入液氮槽vapor phase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。C30 分鐘*) → 80 176。C， 避免反復(fù)冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質(zhì)， 并可減少污染之機(jī)會(huì)。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)之一重要原因。 10 懸浮性細(xì)胞應(yīng)如何繼代處理？ 一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中， 稀釋細(xì)胞濃度即可， 若培養(yǎng)液太多時(shí)， 可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高， 直到無(wú)法容納為止。8 培養(yǎng)基中是否須添加抗生素？除于特殊篩選系統(tǒng)中外， 一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下， 培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。HS (horseserum) 則是指馬血清。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個(gè)極為重要的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源， 所以血清的種類和品質(zhì)對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生極大的影響。2 細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時(shí)， 是否應(yīng)馬上去除DMSO？ 除少數(shù)特別注明對(duì)DMSO 敏感之細(xì)胞外， 絕大部分細(xì)胞株（包括懸浮性細(xì)胞）， 在解凍之后， 應(yīng)直接放入含有1015ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中， 待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)或貼附之問(wèn)題。blue 混合均勻于試管中，取少許混合液加入血球計(jì)數(shù)盤(pán)，計(jì)數(shù)四大方格內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目。一般使用藍(lán)色之trypan blue 染料，如果細(xì)胞不易吸收trypan blue，則用紅色之Erythrosin bluish。. 血球計(jì)數(shù)盤(pán)一般有二個(gè)chambers，每個(gè)chamber 中細(xì)刻9 個(gè)1 mm2 大正方形，其中4 個(gè)角落之正方形再細(xì)刻16 個(gè)小格， mm。C， 5 % CO2 培養(yǎng)箱中，使細(xì)胞回溫至37 176。C， 5 % CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取出已解凍之細(xì)胞懸浮液，緩緩加入T25 或T75 flask 內(nèi)之培養(yǎng)基， 混合均勻，放入37 176。取出冷凍管， 立即放入37 176。絕大多數(shù)之細(xì)胞均無(wú)法立即適應(yīng)不同之基礎(chǔ)培養(yǎng)基或不同之血清種類， 若因?qū)嶒?yàn)需要， 必須有所不同時(shí)， 務(wù)必以緩慢比例漸次改變培養(yǎng)基組成， 確定細(xì)胞適應(yīng)后， 方進(jìn)行所需之實(shí)驗(yàn)?；A(chǔ)篇收到細(xì)胞的處理方式 (一)1. 收到細(xì)胞株包裹時(shí)， 請(qǐng)檢查細(xì)胞株冷凍管是否有解凍情形， 若有請(qǐng)立即通知。 ml 解凍細(xì)胞懸浮液作存活測(cè)試。C 水槽中回溫，回溫后噴以70 % 酒精并擦拭之，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。2. 細(xì)胞活化后，約需數(shù)日，或繼代一至二代，其細(xì)胞生長(zhǎng)或特性表現(xiàn)才會(huì)恢復(fù)正常(例如產(chǎn)生單株抗體或是其它蛋白質(zhì))。. 離心，去除上清液，加入適量冷凍保存溶液，使細(xì)胞濃度為15 x 106 cells/ml，混合均勻，分裝于已標(biāo)示完全之冷凍保存管中，1 ml/vial，并取少量細(xì)胞懸浮液作污染檢測(cè)。適用于懸浮型細(xì)胞與hybridoma 之保存。 . other suspensions: 5~10 x 106cells/ml, human lymphocyte 須至少5 x 106cells/ml。在開(kāi)啟后一年內(nèi)使用，因長(zhǎng)期儲(chǔ)存后對(duì)細(xì)胞會(huì)有毒性。. 冷凍前檢測(cè)細(xì)胞是否仍保有其特有性質(zhì)，例如hybridoma 應(yīng)在冷凍保存前一至二日測(cè)試是否有抗體之產(chǎn)生。 . 融合瘤(hybridoma) . 有些hybridoma cell 需培養(yǎng)三天以上才會(huì)產(chǎn)生抗體，若是更換培養(yǎng)基，則可能會(huì)失去抗體。(若不移去trypsinEDTA，則在trypsinEDTA