【正文】 B兩條帶，無致病力菌株擁有 B帶，過度型菌株擁有 A帶。細菌色譜研究表明，青枯雷爾氏菌在細菌色譜上有 2個峰，無致病力菌株是前峰高于后峰，而強致病力菌株后峰高于前峰，該方法可用于青枯雷爾氏菌細胞的識別（ 9）。青枯雷爾氏菌強致病力菌株與無致病力菌株最后的鑒別方法為利用番茄組培苗回接，統(tǒng)計發(fā)病率（圖 13）。比較轉化 GFP前后的青枯雷爾氏菌無致病力菌株生物學特性，結果表明，其對通氣量要求無差異（圖 16），對初始 pH要求無差異 （圖 17），對溫度的適應無差異（圖 18），生長速度無差異（圖 19）。利用利用青枯雷爾氏菌轉無致病力菌株（ 64）生產出免疫抗病接種劑 鄂魯冷特（圖 24），用于接種番茄盆栽苗，接種鄂魯冷特后 3天，再接種強致病力菌株，對照采用未接種鄂魯冷特的組培苗，同時接種強致病力菌株， 7天后，前者發(fā)病率為 0，后者發(fā)病率為 100%（圖 25），表明免疫抗病接種劑 鄂魯冷特具有很好的免疫抗病效果。 建立了青枯雷爾氏菌分化的細菌色譜鑒定體系 。 后續(xù)研究，植物免疫機理 研究，植物非特異性免疫指標測定，包括接種無致病力菌株后植株酶的變化， phcA基因探針， EPS測定等等。 13 （二） 作物枯萎病 原菌 的遺傳分化及其生物防治研究 1 作物枯萎病 原菌 的遺傳分化 枯萎病是由致病性鐮刀菌引起的一種土傳真菌病害，該病在福建省內發(fā)病嚴重，在瓜類作物（西瓜、黃瓜、甜瓜等）、香蕉、花生等 作物上均有發(fā)生，導致減產 20%～ 30%，嚴重的的田塊可達 50%～80%，甚至絕產。為了分析各個種種內菌株間的遺傳多樣性，我們采用了 RAMS標記， RAMS標記 ]具有微衛(wèi)星分析的穩(wěn)定性和 RAPD分析的普遍性，重復性高，正逐漸應用在病原真菌的研究中。 PCR 反應的每個樣的總體積為 25μL。然后在 Gel Doc 2020 凝膠成像系統(tǒng)（ BioRad）上觀察并貯存圖像。為反映 RAMS標記的多態(tài)性，統(tǒng)計各引物的多態(tài)條帶百分率。 17 圖 5 串珠鐮刀菌聚類分析 圖 6 茄鐮刀菌聚類分析 茄鐮刀菌聚類分析 以 ， 8個茄鐮孢菌 菌株可以聚為 2個類群 ，第 I組群為 辣椒上分離的 2個菌株 ；第 II組群 為花生上分離的 6個菌株。 3） 菌株的遺傳距離和組群劃分與菌株 致病性也存在一定的相關性，如黃瓜分離的 1 株非致病力尖鐮孢菌被獨立劃分為 1 個組群。對尖孢鐮刀菌的生長特性的研究，有助于了解其培 養(yǎng)特性的差異，尋找培養(yǎng)特性的異質性指標， 為研究尖孢鐮刀菌的致病機理提供相關依據(jù)。從培養(yǎng) 7 d 的平板上打取 3 個 6 mm 的菌片，置于盛有 100 mL PSA 液體培養(yǎng)基的 250 mL 三角 瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為 25℃ ，搖床轉速為 110 轉 /分，每天取 3 瓶，過濾去除菌絲，收集發(fā)酵液。 圖 7 發(fā)酵 4 d 的發(fā)酵液 圖 8 發(fā)酵 5 d 的發(fā)酵液 圖 9 發(fā)酵 6 天的發(fā)酵液 發(fā)酵后期 (7d 以后 )，兩株菌保持 6d 時的顏色，變化不大。兩個菌株發(fā)酵過程中 OD 值的變化趨勢非常類似，都隨著發(fā)酵進程， OD 值逐漸增高，在發(fā)酵中期出現(xiàn)一個峰值，在峰值過后，其變化趨于平緩。 表 5 鐮刀菌發(fā)酵過程中 OD 值的變化 發(fā)酵時間 (d) 菌株編號 119 151 1 2 3 4 5 6 菌株 119 菌株 151 菌株 119 菌株 151 菌株 119 菌株 151 19 7 8 9 10 00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11發(fā)酵時間（d ）OD650值菌株1 1 9菌株1 5 1 圖 10 尖孢鐮刀菌發(fā)酵過程中 OD650值的變化 pH值的變化 實驗結果見表 6 和圖 11。尖孢鐮刀菌在偏酸性的條件下生長較好，生長過程使得環(huán)境 pH 逐漸升高，導致生長條件惡化，生長減緩，在偏堿性的條件下尖 孢鐮刀菌生長受到抑制；這也是生產上應用石灰防治枯萎病的原理之一。這可能與菌株的生物學 特性和對培養(yǎng)基的適應性有關。歐氏距離計算結果見表 8，聚類過程見表 9，聚類結果見圖 13。 表 8 歐氏距離距離矩陣 (下叁角 ) 培養(yǎng)時間（ d） 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 表 9 聚類過程 T I J 距離 適應期 對數(shù)期 穩(wěn)定期 1 10 7 2 9 6 3 7 6 4 5 4 5 8 6 6 4 3 7 6 3 8 2 1 9 3 1 圖 13 尖孢鐮刀菌生長階段聚類分析 22 尖孢鐮刀菌生長特性研究的標準培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基采用 PSA 培養(yǎng)基，培養(yǎng)容器 250 mL 三角瓶，裝瓶量 100 mL PSA 液體培養(yǎng)基，接菌量從培養(yǎng) 7 d 的平板上打取 3 個 6 mm 的菌片，培養(yǎng)溫度為25177?？傮w而言，不同寄主的尖孢鐮刀菌在培養(yǎng)過程顏色不同，同一尖孢鐮刀菌生長過程發(fā)酵液顏色會發(fā)生階段性變化。尖孢鐮刀菌生長過程， pH 值逐漸增高，從初期的 逐漸升高為后期的 ，不同的菌株，培養(yǎng)過程 pH 變化差異較小。第 2 階段為對數(shù)期，培養(yǎng)時間為 35d，菌株的 OD 值、 pH 值、菌絲干重變化最大，菌株處于對數(shù)生長階段。培養(yǎng) 48h，加蔗糖組的各菌株菌落直徑比對照增加%%；培養(yǎng) 96h，加蔗糖組的各菌株菌落直徑比對照增加 %%；培養(yǎng) 120h，加蔗糖組的各菌株菌落直徑比對照增加 %%。 02468101248 96 120培養(yǎng)時間 ( h )菌落直徑(cm)不加蔗糖加蔗糖 010203040506070809048 96 120培養(yǎng)時間( h )增長率(%) 圖 18 甜瓜尖孢鐮刀菌（ 132）菌落生長 圖 19 甜瓜尖孢鐮刀菌（ 132）菌落增長率 辣椒尖孢鐮刀菌 （ 147）培養(yǎng) 48h、 96h、 120h，在加蔗糖培養(yǎng)基菌落生長直徑分別為為 、 、 ，分別比同期對照組增加 %、 %、 %（圖 圖 21）。在培養(yǎng) 120h 條件下菌落生長差異極顯著（ P），甜瓜菌株（ 132）和辣椒之間差異極顯著（ P），其余菌株之間差異不顯著 ,表明供試尖孢鐮刀菌在不同蔗糖濃度培養(yǎng)基上菌落直徑變化存在差異，菌落生長趨勢相近。 蔗糖濃度對尖孢鐮刀菌生長的影響結果表明，尖孢鐮刀菌在加蔗糖和不加蔗糖培養(yǎng)基上菌落生長差異極顯著，加蔗糖組尖孢鐮刀菌比未加蔗糖的對照組生長速度快。據(jù)報道碳氮比對于尖到鐮刀菌色素的形成和孢子的長度、分隔都有影響。王拱 辰等 (1995) 選用硝酸鉀、磷酸二氫鉀，再加維生素 B 和 C 組成 VBC 培養(yǎng)基，結果證明能促進多數(shù)尖孢鐮刀菌產孢。s 培養(yǎng)基和 VBC 培養(yǎng)基兩種培養(yǎng)基，改變 碳源和氮源比例，采用固體平板培養(yǎng)法， 研究不同營養(yǎng)條件對尖胞鐮刀菌產孢的影響。在培養(yǎng)基設計上， Bilai39。s 培養(yǎng)基中葡萄糖和蔗糖含量減半， (D)尿素型將 Bilai39。 (B)淀粉型 KH2PO41g； KNO31g； ； ；淀粉 ；蒸餾水 1L。 (F)VBC 型 KH2PO41g； KNO31g；復合維生素 B1 片；維生素 C1 片；蒸餾水 1L。菌株 119 于 PSA 平板上培養(yǎng) 7d 后，刮下菌絲于 100mL 無菌水中，充分振勻，用雙層紗布過濾兩遍制成孢子懸液備用； 配制 上述不同成分的培養(yǎng)基（ AF）， 用 250mL 的三角瓶每瓶盛 50mL 培養(yǎng)液，高壓滅菌，待培養(yǎng)基冷卻后，各加入 1mL 已備好的鐮刀菌孢子懸浮液，另留瓶作空白對照。不同營養(yǎng)條件對黃瓜上分離的尖孢鐮刀菌及對黃瓜、甜瓜、西瓜三種作物上分離的鐮刀菌菌落生長速度差異顯著；以 119 菌株培養(yǎng) 5 天為例，直觀比較菌絲生長的濃密度遞減順序為 D 培養(yǎng)基 E 培養(yǎng)基 C 培養(yǎng)基 F 培養(yǎng)基 A 培養(yǎng)基 B 培養(yǎng)基。 (A)全糖型 培養(yǎng)基 (B)淀粉型 培養(yǎng)基 (C)低糖型 培養(yǎng)基 (D)尿素型 培養(yǎng)基 (E)低氮型 培養(yǎng)基 (F)VBC 型 培養(yǎng)基 圖 24 不同培養(yǎng)基條件下培養(yǎng) 5d 的尖孢鐮刀菌 119 菌株菌落形態(tài) 表 12 不同培養(yǎng)基和不同尖孢鐮刀菌的培養(yǎng) 5d 菌落直徑均值和標準差 培養(yǎng)基類型 均值 標準差 (A)全糖型 (B)淀粉型 (C)低糖型 (D)尿素型 (E)低氮型 (F)VBC 型 27 尖孢鐮刀菌菌株 119 120 123 130 142 表 11 不同培養(yǎng)基和不同尖孢鐮刀菌的培養(yǎng) 5d 菌落直徑方差分析表 變異來源 平方和 自由度 均 方 F 值 顯著水平 處理 1 間 （培養(yǎng)基） 5 處理 2 間 （菌株間） 4 誤差 20 總變異 29 表 12 不同培養(yǎng)基培養(yǎng) 5d 菌落直徑 Tukey 法多重比較 (下叁角為均值差 ,上叁角為顯著水平 ) 培養(yǎng)基 均值 (E)低氮型 (F)VBC 型 (D)尿素型 (A)全糖型 (C)低糖型 (B)淀粉型 (E)低氮型 (F)VBC 型 (D)尿素型 (A)全糖型 (C)低糖型 (B)淀粉型 表 13 不同培養(yǎng)基培養(yǎng) 5d 菌落直徑顯著 性檢驗 培養(yǎng)基 均值 5%顯著水平 1%極顯著水平 (E)低氮型 a A (F)VBC 型 a A （ D)尿素型 a A (A)全糖型 a A (C)低糖型 a A (B)淀粉型 a A 方差分析結果表明，不同培養(yǎng)基和不同尖孢鐮刀菌的培養(yǎng) 5d 菌落直徑，在不同培養(yǎng)基之間差異不顯著 (p)，不同培養(yǎng)基培養(yǎng)形成的菌落直徑在 之間；而在不同尖孢鐮刀菌之間差異極顯著（ P），黃瓜尖孢鐮刀菌 （菌株編號 119）菌落直徑為 、（菌株編號 120）為 cm、 （菌株編號 123）為 cm，甜瓜尖胞鐮刀菌菌株 （菌株編號 130）為 cm，西瓜尖胞鐮刀菌（菌株編號 142）為 cm。 在不同類型培養(yǎng)基上，不同寄主尖孢鐮刀菌菌落生長存在差異，同 一寄主不同菌株之間菌落生長也存在差異，這種差異甚至超過不同寄主的
。不同寄主菌株之間菌落生長存在差異，同一寄主不同菌株之 間菌落生長也存在差異，這種差異甚至超過不同寄主的菌株。 表 12 不同培養(yǎng)基條件下尖孢鐮刀菌菌落的生長速度 供試 培養(yǎng)基 菌落直徑大小（ cm） 5d 7d 119 120 123 130 142 119 120 123 130 142 (A)全糖型 (B)淀粉型 (C)低糖型 (D)尿素型 (E)低氮型 (F)VBC 型 將培養(yǎng) 5d 的不同菌株在不同培養(yǎng)基上的菌落直徑進行方差分析， 不同培養(yǎng)基和不同尖孢鐮刀菌的培養(yǎng) 5d 菌落直徑均值和標準差統(tǒng)計見表表 10；不同培養(yǎng)基和不同尖孢鐮刀菌的培養(yǎng) 5d 菌落直徑方差分析見表 10；不同培養(yǎng)基培養(yǎng) 5d 菌落直徑 Tukey 法多重比較見表 11；不同培養(yǎng)基培養(yǎng) 5d 菌落直徑顯著性檢驗見表 12；不同尖孢鐮刀菌培養(yǎng) 5d 菌落直徑 Tukey 法多重比較見表 13；不同尖孢鐮刀菌培養(yǎng) 5d 菌落直徑顯著性檢驗見表 14。以上實驗用于分析培養(yǎng)基營養(yǎng)成分對 尖孢鐮刀菌落 生長的影響，培養(yǎng)基營養(yǎng)成分對大型分生孢子產孢量的影響，培養(yǎng)基營養(yǎng)成分對大、小型 分生孢子產生比例的影響， 培養(yǎng)基營養(yǎng)成分對小型 胞分生孢子產孢量 的影響。將菌片分別接于不同營養(yǎng)成分的固體平板培養(yǎng)基中央，每個培養(yǎng)皿放 5 塊菌片 ,每個處理重復 5 次。 (D)尿素型 KH2PO41g；尿素 1g； ； ；淀粉 ；葡萄糖 ；蔗糖 ；蒸餾水 1L。s 培養(yǎng)基中 KNO3 含量減半， (F)VBC 型采用 VBC 培養(yǎng)基 (表 8)。s 培養(yǎng)基， (B)淀粉型將 Bilai39。分析不同營養(yǎng)條件下小型分生孢子的產生特性。s 培養(yǎng)基和VBC 培養(yǎng)基營養(yǎng)成份均較全面，都是較好地適應尖孢鐮刀菌產孢的培養(yǎng)基（王拱辰等， 1995）。 培養(yǎng)基成份中影響最大的是碳源，其次是氮源。 聚類分析結果表明，當 λ=，可將菌株分為 3 類，第 1 類 包括了 （ 107）和 （ 119），分別采至班兜和黃瓜寄主，其特點表現(xiàn)為對蔗糖利用率較低；第 2