分子生物學(xué)考點(diǎn)答案(文件)
【正文】 成為一系列可分辨的條帶，單鏈DNA分子的序列由與之互補(bǔ)的多核苷酸鏈的酶促合成來(lái)判定，互補(bǔ)鏈在某一特定的核苷酸位置即加入雙脫氧核苷酸的位置終止。PCR過程中，雙脫氧核糖核酸可能隨機(jī)的被加入到正在合成中的DNA片段里。將PCR反應(yīng)獲得的總DNA通過毛細(xì)管電泳分離，跑到最末端的DNA就可以在激光的作用下發(fā)出熒光。待PCR產(chǎn)物分離純化后除去原來(lái)的引物，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為大引物，并與引物1一起再對(duì)靶基因進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，其PCR產(chǎn)物即為突變的DNA。12什么叫插入失活，舉例說明之？P104 答：在含某個(gè)基因的載體中，將目的基因DNA片段插入該基因，導(dǎo)致該基因的功能失活。（3）PCR篩選法：利用能與插入基因片段兩端互補(bǔ)的特異引物，以少量抽提的重組子DNA為模板進(jìn)行PCR分析，能擴(kuò)增出特異片段的轉(zhuǎn)化子為攜有目的基因的重組子（4）原位雜交：在培養(yǎng)基平板上的菌落或噬菌斑按照其原來(lái)的位置原位不變的轉(zhuǎn)移到濾膜上，并在原位溶菌裂解，DNA變性和用特異探針進(jìn)行雜交，從而鑒定出含有重組子的菌落或噬菌斑。在含有兩個(gè)抗性基因的載體中，如果目的基因DNA片段插入其中一個(gè)抗性基因，就會(huì)導(dǎo)致該抗性基因的功能失活，用兩個(gè)分別含不同抗生素藥物的平板進(jìn)行對(duì)照篩選，可篩選出陽(yáng)性重組子克隆菌體。作用特點(diǎn)：一，同一DNA序列可被不同蛋白質(zhì)識(shí)別；二：同一蛋白質(zhì)因子可與多種不同DNA序列發(fā)生聯(lián)系，多通過蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)先結(jié)合再影響DNA。表達(dá)水平高，約占菌體總蛋白的10％－40％，不能糖基化，產(chǎn)物穩(wěn)定性較差，表達(dá)產(chǎn)物不具有天然蛋白質(zhì)構(gòu)型，大多聚積在細(xì)菌包涵體中，分離純化較復(fù)雜；2）酵母表達(dá)系統(tǒng)：采用啤酒酵母或畢氏酵母。表達(dá)水平僅為細(xì)菌表達(dá)量的5％，表達(dá)產(chǎn)物更接近天然蛋白構(gòu)型，有正確糖基化結(jié)構(gòu)與數(shù)量，通常分泌于胞外培養(yǎng)液內(nèi)，分離純化較簡(jiǎn)易，無(wú)需進(jìn)行復(fù)性加工可獲得高活性生物活性產(chǎn)品。3，有部分人體基因治療計(jì)劃將開始進(jìn)行。3，特異性的核酸，根據(jù)癌基因設(shè)計(jì)出特異的“錘頭”或“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)，它能夠催化切割，降解異常表達(dá)基因的mRNA而影響基因的翻譯。這種胚胎被移植到生殖周期相近的母體之中，可以發(fā)育成為正常動(dòng)物個(gè)體。動(dòng)物克隆技術(shù)不僅理論上有重大突破，無(wú)需有性繁殖即可生產(chǎn)動(dòng)物，而且可利用克隆羊技術(shù)來(lái)克隆人體器官，有醫(yī)學(xué)價(jià)值，還可使難以生殖或即將滅種的動(dòng)物（如熊貓）采用無(wú)性繁殖方式來(lái)繁殖后代，因此引起全世界關(guān)注。需要重復(fù)進(jìn)行DNA模板解鏈、引物與模板DNA結(jié)合、DNA聚合酶催化新生DNA的合成，即高溫變性、低溫退火、中溫延伸３個(gè)步驟構(gòu)成PCR反應(yīng)的一個(gè)循環(huán)，此循環(huán)的反復(fù)進(jìn)行，就可使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。新合成的引物延伸鏈經(jīng)過變性后又可作為下一輪循環(huán)反應(yīng)的模板PCR，就是如此反復(fù)循環(huán)，使目的DNA得到高效快速擴(kuò)增。24試述腫瘤的發(fā)生機(jī)理。26試述p53對(duì)腫瘤的作用及其機(jī)理.p53是一種腫瘤抑制基因，p53是一個(gè)重要的抗癌基因使癌細(xì)胞自殺，防止癌變；還具有幫助細(xì)胞基因修復(fù)缺陷的功能?；静僮鞑襟E：1提取目的基因2目的基因與運(yùn)載體結(jié)合3將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4目的基因的檢測(cè)和表達(dá)8 / 8。是將外源基因通過體外重組后導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)，使這個(gè)基因能在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯表達(dá)的操作。 答：細(xì)胞周期素和CDK等細(xì)胞周期相關(guān)蛋白過表達(dá)或者缺陷，特別是那些決定細(xì)胞有G1進(jìn)入S期的蛋白若表達(dá)異常，使細(xì)胞周期進(jìn)程超越或突破細(xì)胞周期的控制點(diǎn)，細(xì)胞不能正常發(fā)生細(xì)胞自發(fā)產(chǎn)生的細(xì)胞死亡，衰老或分化，從而造成細(xì)胞惡化增生，形成惡性腫瘤。這樣低濃度的mRNA被擴(kuò)增放大易于檢測(cè)。退火：引物＋單鏈DNA 雜交鏈，引物的Tm值。22 PCR基本原理PCR是在試管中進(jìn)行的DNA復(fù)制反應(yīng)，基本原理是依據(jù)細(xì)胞內(nèi)DNA半保留復(fù)制的機(jī)理，以及體外DNA分子于不同溫度下雙鏈和單鏈可以互相轉(zhuǎn)變的性質(zhì)，人為地控制體外合成系統(tǒng)的溫度，以促使雙鏈DNA變成單鏈，單鏈DNA與人工合成的引物退火，然后耐熱DNA聚合酶以dNTP為原料使引物沿著單鏈模板延伸為雙鏈DNA。這種不經(jīng)過有性生殖過程，而是通過核移植生產(chǎn)遺傳結(jié)構(gòu)與細(xì)胞核供體相同動(dòng)物個(gè)體的技術(shù)，就叫做動(dòng)物克隆。21何謂“動(dòng)物克隆技術(shù)”？有何應(yīng)用價(jià)值？答：動(dòng)物克隆是一種通過核移植過程進(jìn)行無(wú)性繁殖的技術(shù)。答：1，將特異的反義基因重組到表達(dá)載體上，導(dǎo)入靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄出反義RNA，形成雙鏈RNA,阻礙基因的翻譯。應(yīng)用：1，現(xiàn)在已有部分基因的基因治療計(jì)劃在執(zhí)行標(biāo)記或治療。表達(dá)水平1－500mg/L,具有良好的翻譯后修飾功能，表達(dá)產(chǎn)物接近天然的蛋白構(gòu)型，糖基化結(jié)構(gòu)和數(shù)量稍有差異。四：反式作用元件在合成過程中有相當(dāng)大的可變性和可塑性。作用特點(diǎn)：是能夠與DNA結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合的特定序列的DNA片段，決定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄效應(yīng)。這樣形成的雜種DNA分子的每一個(gè)連接位點(diǎn)中，載體DNA都只有一條鏈?zhǔn)峭庠碊NA連接上的，而另外一條鏈由于失去了5/P基團(tuán)，不能作此連接，故留下一個(gè)具有3/OH和5/OH的缺口，盡管如此，這樣的DNA分子仍然可以導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞，并在寄主細(xì)胞內(nèi)完成缺口的修復(fù)工作。13如何從所克隆到的基因重組體載體中鑒定基因的存在和正確性？答：（1）重組子大小鑒別篩選：重組子中裝有一段較大分子量的外源性基因，其分子量明顯比原載體大很多，因此可將提取的重組載體和原載體，用一種限制性內(nèi)切酶消化后，直接進(jìn)行凝膠電泳，從而據(jù)其電泳特性而初步篩選重組子中是否插入外源基因片段。三大技術(shù)發(fā)明：工具酶的發(fā)明（內(nèi)切酶、合成酶、連接酶）；基因合成和測(cè)序（合成儀、測(cè)序儀）；PCR技術(shù)（PCR擴(kuò)增儀）。8試?yán)L圖并說明大引物PCR定點(diǎn)誘變法的過程。最終的結(jié)果是獲得所有可能獲得的、不同長(zhǎng)度的DNA片段。是Sanger于1975年發(fā)明的。根據(jù)限制酶的結(jié)構(gòu),輔因子的需求切位與作用方式，可將限制酶分為三種類型，分別是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。過程： 1)取材：mRNA約占總RNA的1－5％，所以應(yīng)選用目的
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