【正文】 應(yīng)以及散射光等因素，EEM表示為單個組分的線性和： （9）從式（9）的表示形式可以看出，如果吸光強度達到一定程度，并且各個組分之間不會發(fā)生能量的轉(zhuǎn)移，在沒有其他外界物質(zhì)干擾的條件下，系統(tǒng)檢測得到的整個物質(zhì)體系的熒光強度是單個組分的熒光強度的疊加。當激發(fā)單色器改為濾光片時則為一般的熒光計。儀器由計算機控制，可獲得同步熒光光譜、三維熒光光譜和時間分辨熒光光譜。（1）高壓氙弧燈目前熒光分光光度計中應(yīng)用最廣泛的一種光源。氙弧燈的光譜輸出，短于280nm區(qū)的強度迅速下降。低壓汞燈發(fā)射的光譜是一些分立的線狀光譜，主要能量集中在紫外線區(qū)。可調(diào)諧染料激光器是一種用有機熒光料作為工作溶液，用其他光源或激光作為激勵的激光器。激光器作為光源比高壓汞燈與氙燈具有更好的穩(wěn)定性，并且體積小、功耗低、工作壽命長。機刻光柵的主要缺點是線槽不完善，雜散光較大，可能存在“鬼影”。對于一般熒光分光光度計來說，單色器的分辨率不是主要問題，因為熒光計的熒光峰寬度很少小于5nm。雜散光被定義為出去所需要波長的光線以外，通過單色器的所有其他光線的強度?，F(xiàn)在讓我們考慮發(fā)射單色器。假設(shè)340nm對280nm的分辨率為，280nm波長處的散射光強度可能比340nm波長處的熒光強度一千多倍。 3）樣品池熒光分光光度計的樣品池通常用石英材料做成，它與吸光分析法的液池的不同在于，熒光樣品池的四面均為磨光透明面，同時一般僅有厚度為1cm的池。由于光譜儀占用面積大、條件苛刻，使其應(yīng)用范圍局限在實驗室中使用，不能進行實時在線檢測。由于其存儲的載流子數(shù)目與光強有關(guān)，因此一個光學(xué)圖像就可以被轉(zhuǎn)化成電荷圖像，然后使電荷按一定的順序轉(zhuǎn)移，最后在輸出端輸出，從而使光學(xué)信號轉(zhuǎn)變成視頻信號。而面陣CCD是由許多像素排列成一方陣并以一定的形式聯(lián)接起來的一個器件。但其缺點是處理信息速度慢，而且價格昂貴。第3章 石油類有機物三維熒光光譜的實驗研究第3章 石油類有機物三維熒光光譜的實驗研究本實驗所用的儀器為日立F7000熒光分光光度計。掃描速度為12000 nm/min，掃描步長均為5nm。CCl4是分析化學(xué)中常用的有機溶劑，可用于提取石油類有機物。1）濃度為100mg/L的標準溶液配制目的：用于得到柴油、汽油、煤油單組分混合于CCl4溶液后的特征光譜。分析結(jié)果表明只有溶液的濃度在 1g/L以下時才能測到熒光，當濃度小于 10ppm時，熒光強度峰值急劇減小[19]。標準溶液的濃度越高，所需溶劑CCl4溶液的量越大。對應(yīng)地表水上述五類水域功能，將地表水環(huán)境質(zhì)量標準基本項目標準值分為五類，不同功能類別分別執(zhí)行相應(yīng)類別的標準值。其間隔濃度梯度設(shè)定為不均勻分配。各樣本中溶質(zhì)濃度如表2所示。吸入極高濃度可迅速出現(xiàn)昏迷、抽搐，可因室顫和呼吸中樞麻痹而猝死。因為熒光分光光度計可提供很高的靈敏度，所以比色池的輕微污染會影響測量結(jié)果。儀器掃描柴油、汽油、煤油三種純樣品的三維熒光光譜圖和等高線光譜圖，目的是觀察本身所產(chǎn)生熒光效應(yīng)的強度大小，以及其與混合于有機溶液的柴油、汽油和煤油的譜圖有何區(qū)別，熒光性質(zhì)受何影響。因每種油類最佳波長范圍不同，激發(fā)波長與發(fā)射掃描波長范圍視情況而定。圖9 純97汽油的三維熒光光譜圖 Threedimensional fluorescence spectrum of pure 97 gasoline sample圖10 純97汽油的等高線光譜圖 Contour spectrum of pure 97 gasoline sample結(jié)合兩幅圖與儀器所顯示的報告數(shù)據(jù)可知，純97汽油在激發(fā)波長380nm、發(fā)射波長410nm處有最大熒光強度值，次顯著熒光波峰則分別在激發(fā)波長360nm、發(fā)射波長405nm，激發(fā)波長380nm、發(fā)射波長430nm兩處。一般說來，石油類有機物都具有大致相同的物理化學(xué)性質(zhì)，但是不同地區(qū)、不同油層中石油的化學(xué)組成也有著明顯的差異，這反映出了石油組成的多樣性。F7000熒光分光光度計測量參數(shù)設(shè)置為：由于適合于每種油的最佳波長范圍不同，為避免掃描到非樣品波譜范圍內(nèi)的其他干擾波峰，獲得更為準確的實驗數(shù)據(jù)，對其分別進行合理設(shè)置。電壓強度為400V，響應(yīng)時間調(diào)為自動模式。將F7000熒光分光光度計的測量參數(shù)設(shè)置與本底溶劑CCl4相同。圖中傾斜向右上方延伸的呈等高線狀條紋為入射光激發(fā)而產(chǎn)生的微弱瑞利散射光，沒有其余銳鋒出現(xiàn)，說明它的熒光強度比石油類有機物受激發(fā)射的熒光強度小很多，可忽略不計。激發(fā)狹縫寬度為10nm，發(fā)射狹縫寬度為10nm。掃描三種純油類樣品，所呈現(xiàn)出的熒光特征光譜各不相同，但由于它們的化學(xué)組成中具有某些相同的烴類物質(zhì)成分，因而在某些波長范圍內(nèi)，光譜存在相互重疊現(xiàn)象。圖11 純煤油的三維熒光光譜圖 Threedimensional fluorescence spectrum of pure kerosene sample圖12 純煤油的等高線光譜圖 Contour spectrum of pure kerosene sample結(jié)合兩幅圖與儀器所顯示的報告數(shù)據(jù)可知，純煤油的光譜最為簡單，僅在激發(fā)波長330nm、發(fā)射波長350nm處存在一個顯著的熒光波峰。圖7 純0柴油的三維熒光光譜圖 Threedimensional fluorescence spectrum of pure 0 diesel sample圖8 純0柴油的等高線光譜圖 Contour spectrum of pure 0 diesel sample結(jié)合兩幅圖與儀器所顯示的報告數(shù)據(jù)可知，純0柴油在激發(fā)波長325nm、發(fā)射波長425nm，激發(fā)波長400nm、發(fā)射波長430nm處有兩個熒光強度值相近的顯著熒光波峰。掃描速度為12000 nm/min，掃描步長均為5nm。決不要在比色池內(nèi)留有樣品，試劑的蒸發(fā)，樣品的殘余可能黏附在比色池的壁上而造成污染。所有操作應(yīng)在通風櫥內(nèi)進行。表1 校正樣本的濃度Table1 Concentration of calibration samples校正樣品（mg/L）樣號柴油汽油煤油12345678910表1 （續(xù)）校正樣品（mg/L）樣號柴油汽油煤油1112132020201440404015808080168040201720804018402080表2 預(yù)測樣本的濃度Table2 Concentration of prediction samples預(yù)測樣品（mg/L）樣號柴油汽油煤油192021222324252627506080286080502980506030606060CCl4有毒，對人體健康有危害。石英比色皿3個；容量瓶30個，體積為50ml，容量瓶6個，體積為100ml， 用于配置所需濃度的溶液；燒杯3個，體積為100ml；微量取液容器2支，體積分別為10100μl，1001000μl；電子天平。3）制得三種油類的標準溶液后，配制三種油類不同濃度混合于CCl4溶液的溶液樣本，用于模擬石油類有機物溶于有機溶劑形成的復(fù)雜混合體系。綜合以上分析結(jié)果，可設(shè)定本實驗混合液樣品濃度為100ppm，即約100mg/L； 圖6 熒光強度分布同溶液濃度之間的關(guān)系 Relationship between fluorescence intensity distribution and solution concentration（3）為了盡量減小配比混合液時產(chǎn)生的誤差。由于所處理的數(shù)據(jù)具有它的性質(zhì)特征，若PARAFAC分解后所得發(fā)射光譜與真實的特征光譜非常吻合，則證明了平行因子分析法分解的唯一性和準確性。首先采用逐級稀釋的方法配制待測三種石油類有機物的標準溶液（一定濃度的單一組分三種油類分別與CCl4溶液混合而成的混合溶液），即母溶液。本實驗選取某0柴油，某97汽油，某普通煤油這三種石油類有機物作為研究樣品。儀器測量參數(shù)設(shè)置：激發(fā)波長范圍為 250~430nm，發(fā)射波長范圍為310~520nm。圖5 日立F7000熒光分光光度計 Hitachi F7000 fluorescence spectrophotometerF7000具有超高靈敏度、超高掃描速度、獨特的光柵和水平狹縫光路設(shè)計，適用于高靈敏度的熒光痕量分析（物質(zhì)中含量在百萬分之一以下的組合的分析方法），應(yīng)用于材料、藥學(xué)和生命科學(xué)等高科技領(lǐng)域和質(zhì)控、教學(xué)等常規(guī)分析領(lǐng)域以及混合有機化合物的分析，復(fù)雜化合物的指紋譜圖庫分析比如芳香族化合物、中藥、環(huán)境檢測等。因此，CCD檢測器具有連續(xù)對熒光光譜多次采集，得到強度波長時間三維圖譜的功能。但其處理信息的速度快，后續(xù)電路簡單。一種是線陣CCD，一種是面陣CCD。CCD具有光譜范圍寬、量子效率高、暗電流小、噪聲低、靈敏度高、線性范圍寬，同時具備可一次性獲得熒光二維光譜，獲取彩色、三維圖像等特點。PMT是一種很好的電流源，在一定的條件下，其電流量與入射光強度成正比。由于散射光100%偏振，因此，散射光所引起的雜散光可能使熒光各向異性的測量失效，這一點要特別留意。假設(shè)我們測量的是一個濁度較高的生物樣品，例如測量鍵合蛋白質(zhì)的熒光強度，該樣品用280nm光激發(fā)，于340nm處測量熒光強度。許多生物樣品都有較大的濁度，結(jié)果入射的雜散光被樣品散射而干擾熒光強度的測量。對于光敏性的熒光體測量，有必要適當減少入射光的強度。光柵單色器有兩個主要性能指標，即色散能力和雜散光水平，色散能力通常以nm/mm表示，其中mm為單色器的狹縫寬度。光柵分為平面光柵和凹面光柵兩類?？烧{(diào)諧激光器是激光Shpol’s skii熒光光譜法不可少的激發(fā)光源。由于高壓汞燈發(fā)射出較強的365nm線（熒光分析中常用366nm線作為激發(fā)光），因此，一般濾光片式熒光計多采用它為激發(fā)光源。（2）高壓汞燈 汞燈是初期熒光計的主要激發(fā)光源，它是利用汞蒸氣放電發(fā)光的光源，它所發(fā)射的光譜與燈的汞蒸氣壓有關(guān)。其工作時，在相距約8mm的鎢電極間形成一強的電子流（電?。?，氙原子與電子流相撞而離解為氙正離子，氙正離子與電子復(fù)合而發(fā)光。圖4 熒光分光光度計 Fluorescence spectrophotometer熒光分光光度計的各主要部件如下：1）激發(fā)光源 熒光分光光度計的激發(fā)光源應(yīng)具有足夠的強度、適用波長范圍寬、穩(wěn)定等特點。試樣前的第一單色器（激發(fā)單色器）可對光源進行分光，選擇激發(fā)光波長，實現(xiàn)激發(fā)光波長掃描以獲得激發(fā)光譜。光源用來激發(fā)樣品，單色器用來分離出所需要的單色光，信號檢測放大系統(tǒng)用來把熒光信號轉(zhuǎn)化為電信號，聯(lián)結(jié)于放大裝置上的讀出裝置，用來顯示或記錄熒光信號。假定EEM為三種因子的乘積，其表示濃度相關(guān)的系數(shù)，表示熒光發(fā)射光譜矩陣，表示激發(fā)光譜矩陣。復(fù)雜體系的總熒光需用熒光強度、激發(fā)波長和發(fā)射波長三個參數(shù)來加以表征。等高線圖反映了熒光強度與激發(fā)波長、發(fā)射波長之間的變化關(guān)系，它能提供較多的熒光特征信息。是指任何固定的角度從立體圖所觀察到的投影圖，該形式比較直觀，坐標X代表發(fā)射光波長、Y代表激發(fā)光波長、Z代表熒光強度值。常規(guī)的熒光分析法測得的熒光光譜是一條曲線，而三維熒光光譜法得到是一個熒光矩陣，描述了熒光強度同時隨激發(fā)波長和發(fā)射波長變化的關(guān)系譜圖。三維熒光光譜投影得到的等高線熒光光譜測試分析工作中也有許多應(yīng)用[42]。以熒光強度、激發(fā)光譜和發(fā)射光譜為坐標可獲得三維熒光光譜圖，也稱總發(fā)光光譜。其缺點在于對于高階導(dǎo)數(shù)光譜來講，信噪比較低。熒光偏振測量方法在環(huán)境科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。利用不同熒光物質(zhì)間熒光壽命不同的特點來鑒別熒光光譜，它與時間分辨的不同之處在于熒光壽命的計算是通過激發(fā)光和熒光間的相位角來獲得的。2）時間分辨熒光分析法（TimeResolved Fluorometry）。同步熒光法按光譜掃描方式的不同可分為恒（固定）波長法、恒能量法、可變角法和恒基體法。計算機技術(shù)的不斷更新?lián)Q代，極大地推動了熒光測量技術(shù)的發(fā)展，熒光分析方法被廣泛應(yīng)用于物質(zhì)結(jié)構(gòu)與成分的分析。這些參數(shù)反映了分子的各種特性，能從不同角度提供研究對象的分子的信息。2）選擇性強。在一定范圍內(nèi)，激發(fā)光強度越大，受激發(fā)射的熒光強度越強，當超過這個范圍時，激發(fā)光的強度再增大，將會引起熒光物質(zhì)感光分解，熒光強度減弱。當濃度達到，此時由（5）式知可以變成，熒光強度與溶液濃度無關(guān)。當一束強度為的紫外或可見光照射濃度為，液層厚度為的液槽時，可在溶液的各個方向觀察到熒光。強度要比拉曼散射光的強度大很多，有幾千倍之余。石油類物質(zhì)是復(fù)雜的多組分混合體系，其熒光不僅受溶劑影響，不同芳烴化合物溶質(zhì)之間也會相互影響，可能發(fā)生熒光熄滅效應(yīng)的非線性加和，改變各組分的淬滅濃度，或者形成多元配合物，增大熒光強度。4）溶液熒光的猝滅熒光分子與溶劑分子或其他分子之間相互作用，使熒光強度減弱的現(xiàn)象稱為熒光猝滅。溫度只對熒光強度大小產(chǎn)生影響，石油類的熒光強度值隨著溫度的變化呈梯度走勢[39]。2） 溫度的影響熒光強度對溫度變化十分敏感。選擇合適的條件不但可以使熒光加強，提高測定的靈敏度，同時，還可以控制干擾物質(zhì)的熒光產(chǎn)生，改善分析的選擇性。有吸電子基團，如：X、NOCOOH等時熒光減弱。共軛度越大，發(fā)射波長紅移，發(fā)光強度增加。強熒光物質(zhì)的特征表現(xiàn)在[37]：1）躍遷類型大多數(shù)熒光化合物都是由π→π*或n→π*躍遷所致的激發(fā)態(tài)去活后，發(fā)生π*→π或π*→n躍遷產(chǎn)生