【正文】 氰化鉀 （ KCN） 培養(yǎng)基。 半固體瓊脂。 4 操作步驟 前增菌 稱取 25 g （ mL）樣品放入盛有 225 mL BPW 的無菌均質(zhì)杯中，以 8 000 r/min ～ 10 000 r/min 均質(zhì) 1 min～ 2 min，或置于盛有 225 mL BPW 的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打 1 min～ 2 min。 無菌操作將樣品轉(zhuǎn)至 500 mL錐形瓶中，如使用均質(zhì)袋，可直接進(jìn)行培養(yǎng)，于 36 ℃177。 1 ℃培養(yǎng) 18 h ～ 24 h 。于 36 ℃177。 XLD 瓊脂 菌落呈粉紅色，帶或不帶黑色 中心，有些菌株可呈現(xiàn)大的帶光澤的黑色中心，或呈現(xiàn)全部黑色的菌落；有些菌株為黃色菌落，帶或不帶黑色中心。在三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基內(nèi)，沙門氏菌屬的反應(yīng)結(jié)果見表 2 。1 ℃培養(yǎng) 18 h ～ 24 h ，必要時(shí)可延長至 48 h ，按表 3 判定結(jié)果。如尿素、 KCN 和賴氨酸脫羧酶 3 項(xiàng)中有 1 項(xiàng)異常，按表 4 可判定為沙門氏菌。 反應(yīng)序號(hào) A3：補(bǔ)做 ONΜ G 。－表示陰性。 在第一法中，薄層板上黃曲霉毒素氏的最低檢出量為 0. 000 4μ g，檢出限為5μ g/ B1 的檢出限為 μ g/kg. 2 原理 試樣中黃曲霉毒素 B1 經(jīng)提取、濃縮、薄層分離后，在波長 365 nm紫外光下產(chǎn)生藍(lán)紫色熒光，根據(jù)其在薄層上顯示熒光的最低檢出量來測定含量。 硅膠 G:薄層色譜用 三氟乙酸 . 無水硫酸鈉 . 氯化鈉 3. 12 苯一乙腈混合液 :量取 98 mL 苯，加 2 mL 乙腈，混勻。 =................................(1) 式中 : — 重鉻酸鉀溶液的摩爾消光系數(shù) 。 若 f大于 或小于 ，則使用儀 器的校正因素可略而不計(jì)。 結(jié)果什算 :黃曲霉毒素 B1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度按式 (3)進(jìn)行計(jì)算。 M黃曲霉毒素 B1 的分子量 312。 10O)溶于 500 mL 溫水中，再將兩液混合、攪拌，澄清后過濾。 電動(dòng)振蕩器 . 全玻璃濃縮器。為避免取樣帶來的誤差，應(yīng)大量取樣，并將該大量試樣粉碎，混合均勻，才有可 能得到確能代表一批 試樣的相對(duì)可靠的結(jié)果，因此采樣應(yīng)注意以下幾點(diǎn) . 根據(jù)規(guī)定采取有代表性試樣。 提取 (限于玉米、大米、小麥及其制品 )，稱取 20. 00 g 粉碎過篩試樣于 250 mL具襄錐形瓶中，用滴管滴加約 6 mL 水，使試樣濕潤，準(zhǔn)確加入 60 mL 三氯甲烷，振蕩 30 min，加 12 g 無水硫酸鈉，振搖后，靜置 30 min，用疊成折疊式的快速定性撼紙過濾于 100 mL 具塞錐形瓶中。在空氣中干燥約 15 min 后 .在 100℃活化 2h，取出，放干燥器中保存。滴加樣式如下 : 第一點(diǎn) :10 μ L 黃曲霉毒素 B1 標(biāo)準(zhǔn)使用液 (( p 以 mL). 第二點(diǎn) :20 μ L 樣液。 . . 1 由于樣液點(diǎn)上加滴黃曲霉毒素殘標(biāo)準(zhǔn)使用液，可使黃曲霉毒素 B1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)與樣液中的黃曲霉毒素 B1 熒光點(diǎn)重疊。 再展開 (同 ),在紫外光燈下觀察樣液是否產(chǎn)生與黃曲排毒素殘標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)相同的衍生物 .未加三氟乙酸的三、四兩點(diǎn)，可依次作為樣液與標(biāo)準(zhǔn)的衍生物空白對(duì)照。178。178。178。178。178。 (4) 式中 : X— 試樣中黃曲霉毒素的含量，單位為微克每千克 (μ g/kg)。 4黃曲霉毒素的最低檢出量，單位為微克 (μ g). 結(jié)果表示到測定值的整數(shù)位 . 雙向展開法 如用單向展開法展開后，薄層色 譜由于雜質(zhì)干擾掩蓋了黃曲霉毒素 B1的熒光強(qiáng)度，需采用雙向展開法 .薄層板先用無水乙醚作橫向展開，將干擾的雜質(zhì)展至樣液點(diǎn)的一邊而黃曲霉毒素 B1 不動(dòng)，然后再用丙酮一三氯甲烷 (8+92)作縱向展開，試樣在黃曲霉毒素 B1 相應(yīng)處的雜質(zhì)底色大量減少，因而提高了方法靈敏度。 . 1. 縱向展開 :揮干的薄層板以丙酮一三氯甲烷 (8+92)展開至 10 cm12 cm為止 .丙酮與三氯甲烷的比例根據(jù)不同條件自行調(diào)節(jié) . . 觀察及評(píng)定結(jié)果 . . 1 在紫外光燈下觀察第一、二板，若第二板的第二點(diǎn)在黃曲霉毒素B1 標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的相應(yīng)處出現(xiàn)最低檢出量，而第一板在與第二板的相同位置上未出現(xiàn)熒光點(diǎn)，則試樣中黃曲霉毒素 B1 含量在 5μ g/kg 以下。在距左邊緣 cm3 cm處，于第四板滴加 20 μ L 樣液及 1 小滴三氟乙酸，于 第五板滴加 20 μL 樣液 ,10 μ L 黃曲霉毒素 B1 標(biāo)準(zhǔn)使用液 (0. 04 μ g/mL)及 1 小滴三氟乙酸，反應(yīng) 5 min 后，用吹風(fēng)機(jī)吹熱風(fēng) 2 min，使熱風(fēng)吹到薄層板上的溫度不高于 40℃。 結(jié)果計(jì)算 同 . . 滴加一點(diǎn)法 點(diǎn)樣 :取薄層板三塊，在距下端 3cm基線上滴加黃曲霉毒素 B1 標(biāo)準(zhǔn)使用液與樣液。觀察時(shí)，可將第一板作為樣液的衍生物空白板 .如樣液黃曲霉毒素 B1 含量高時(shí)，則將樣液稀釋后，按 做確證試驗(yàn)。如按順序做，當(dāng)在第一板出現(xiàn)陰性時(shí) .第三板可以省略。 滴加兩點(diǎn)法 點(diǎn)樣 取薄層板三塊，在距下端 3 cm基線上滴加黃曲霉毒素 B1 標(biāo)準(zhǔn)使用液與樣液 .即在三塊板的距左邊緣 0. 8 cm1 em處各滴加 10 μ L 黃曲霉毒素 B1 多準(zhǔn)使用液 ( 5g/mL)，在距左邊緣 cm3 cm處各滴加 20 μ L 樣液，然后在第二塊板的樣液點(diǎn)上加滴 10 $L 黃曲霉毒家 K 標(biāo)準(zhǔn)使用液 (0. 04 5 以 mL)，在第三塊板的樣液點(diǎn)上加滴 10 μ L 0. 2 5g/mL 黃曲奮貢累“， 。 D 樣液的總稀釋倍數(shù) ?！?178。178。178。178。178。滴加式樣如下 : 第一點(diǎn) :10 μ L 黃曲霉毒素 B1 標(biāo)準(zhǔn)使用液 (( 5g/mL). 第二點(diǎn) :根據(jù)情況滴加 10 μ L 樣液 . 第三點(diǎn) :根據(jù)情況滴加 15 μ L 樣液 . 第四點(diǎn)，根據(jù)情況滴加 20 μ L 樣液。如為陽性，則起定性作用 .薄層板上的第四點(diǎn)中黃曲霉毒素 B1為 gig，主要起定位作用 . 若第二點(diǎn)在與黃曲霉毒素 B1 標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的相應(yīng)位置上無藍(lán)紫色熒光點(diǎn)，表示試樣中黃曲霉毒素 B1 含量在 5μ L/kg 以下 。再于另一展開槽內(nèi)加 10 mL 丙酮一三氮甲烷 (8+92),展開 10 cm12 cm，取出。 :將薄層板邊緣附肴的吸附劑刮凈，在距薄層板下端 3 cm的基線上用微量注射器或血色 素吸管滴加樣液 .一塊板可滴加 4 個(gè)點(diǎn)，點(diǎn)距邊緣和點(diǎn)間距約為 1 3 mm。 測定 . 1 單向展開法 薄層板的制備 :稱取約 3g硅膠 G，加相當(dāng)于硅膠量 2 倍 ~3 倍左右的水，用力研磨 1 min2 min 至成糊狀后立即倒于涂布器內(nèi) .推成 5 cm179。 . 5 kg I kg，然后全部粉 碎 .糧食試樣全部通過 20 目篩，混勻 .花生試樣全部通過 10 目篩，混勻 .或?qū)⒑?、壞分別測定，再計(jì)算 其含量。 展開槽 :內(nèi)長 25 cm、寬 6 cm、高 4 cm. 紫外光燈 :100 W125 W，帶有波長 365 nm濾光片 . 微量注射器或血色素吸管。 儀器 小型粉碎機(jī)。 3. 原點(diǎn)上沒有任何殘留的熒光物質(zhì)。 A 測得的吸光度值。該標(biāo)準(zhǔn)溶液約為 10μ g/mL。 再以此平均值與重鉻酸鉀的摩爾消光系數(shù)值 3 160 比較，即求出使用儀器的校正因素 .按式 (2)進(jìn)行計(jì)算。再吸取 25 mL 此稀釋液于 50 mL容量瓶中，加琉酸 (+1 000)稀釋至刻度，相當(dāng)于 0. 000 2 mol/L 溶液 .再吸取 25 mL 此稀釋液于 50 mL 容量瓶中，加硫酸 ((+1000)稀釋至刻度，相當(dāng)于 0. 000 1 mol/L 溶液。 正己烷或石油醚 (沸程 3039。 5 結(jié)果與報(bào)告 綜合以上生化試驗(yàn)的結(jié)果，報(bào)告 25 g （ mL）樣品中檢出或未檢出沙門氏菌。 必要時(shí)按表 5 進(jìn)行沙門氏菌生化群的鑒別。 表 4 沙門氏菌 屬生化反應(yīng)初步鑒別表 pH 尿素 氰化鉀（ KCN） 賴氨酸 脫羧酶 判定結(jié)果 － － － 甲型副傷寒沙門氏菌（要求血清學(xué)鑒定結(jié)果） － ＋ ＋ 沙門氏菌Ⅳ或Ⅴ（要求符合本群生化特性） ＋ － ＋ 沙門氏菌個(gè)別變體（要求血清學(xué)鑒定結(jié)果） 注：＋表示陽性；＋表示陰性。 表 3 沙門氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒別表 反應(yīng)序號(hào) 硫化氫（ H2S） 靛基質(zhì) pH 尿素 氰化鉀（ KCN） 賴氨酸脫羧酶 A1 ＋ － － － ＋ A2 ＋ ＋ － － ＋ A3 － － － － ＋ /－ 注：＋陽性；－陰性；＋ /－陽性或陰性。 接種三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基的同時(shí) , 可直接接種蛋白胨水 （供做靛基質(zhì)試驗(yàn)）、尿素瓊脂 （ ）、氰化鉀 （ KCN） 培養(yǎng)基，也可在初步判斷結(jié)果后從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取可疑菌落接種。 生化試驗(yàn) 自選擇性瓊脂平板上分別挑取 2 個(gè)以上典型或可疑菌落，接種三糖鐵瓊脂，先在斜面劃線，再于底層穿刺；接種針不要滅菌 , 直接接種賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂平板，于 36 ℃177。 表 1 沙門氏菌屬在不同選擇性瓊脂平板上的菌落特征 選擇性瓊脂平板 沙門氏菌 BS 瓊脂 菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色，菌落周圍培養(yǎng)基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰綠色的菌落，周圍培養(yǎng)基不變。 1 ℃培養(yǎng) 18 h ～ 24 h 。 如為冷凍產(chǎn)品 , 應(yīng) 在 45 ℃以下不超過 15 min,或 2 ℃～ 5 ℃不超過 18 h 解凍。如需測定 pH 值，用 1 mol/mL 無菌 NaOH 或 HCl 調(diào) pH 至 177。 沙門氏菌 O 和 H 診斷血清。 糖發(fā)酵管。 蛋白胨水、靛基質(zhì)試劑。 HE 瓊脂。 3 培養(yǎng)基和試劑 緩沖蛋白胨水（ BPW）。 75 mm。 無菌吸管： 1 mL（具 mL 刻度）、 10 mL （具 mL 刻度） 或微量移液器及吸頭。 均質(zhì)器。 2 設(shè)備和材料 除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下： 冰箱： 2 ℃～ 5 ℃。 如選擇生化鑒定試劑盒或全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)，可根據(jù) 的初步判斷結(jié)果，用 中已培 養(yǎng)的營養(yǎng)瓊脂斜面上生長的菌苔，使用生化鑒定試劑盒或全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。 附加生化實(shí)驗(yàn) 由于某些不活潑的大腸埃希氏菌（ anaerogenic ）、 AD（ AlkalescensD isparbiotypes 堿性 異型）菌的部分生化特征與志賀氏菌相似，并能與某種志賀氏菌分型血清發(fā)生凝集；因此前面生 化實(shí)驗(yàn)符合志賀氏菌屬生化特性的培養(yǎng)物還需另加葡萄糖胺、西蒙氏檸檬酸鹽、粘液酸鹽試驗(yàn) (36 ℃培養(yǎng) 24 h～ 48 h)。半乳糖苷酶 － a － a + 尿素 － － － － 賴氨酸脫羧 － － － － 酶 鳥氨酸脫羧酶 － － － b + 水楊苷 － － － － 七葉苷 － － － － 靛基質(zhì) － /＋ (＋ ) － /＋ － 甘露醇 － ＋ c ＋ + 棉子糖 － ＋ － ＋ 甘油 (＋ ) － (＋ ) d 注： +表示陽性； 表示陰性； /+表示多數(shù)陰性； +/表示多數(shù)陽性；（ +）表示遲緩陽性； d 表示有不同生化型。另外由于福氏志賀氏菌 6 型的生化特性和痢疾志賀氏菌或鮑氏志賀氏菌相似，必要時(shí)還需加做靛基質(zhì)、甘露醇、棉子糖、甘油試驗(yàn)，也可做革蘭氏染色檢查和氧化酶試驗(yàn)，應(yīng)為氧化酶陰性的革蘭氏陰性桿菌 。 凡是三糖鐵瓊脂中斜面產(chǎn)堿、底層產(chǎn)酸（發(fā)酵葡萄糖，不發(fā)酵乳糖，蔗糖）、不產(chǎn)氣（福氏志賀氏菌 6 型可產(chǎn)生少量氣體）、不產(chǎn)硫化氫、半固體管中無動(dòng)力的菌株，挑取其 中已培養(yǎng)的營養(yǎng)瓊脂斜面上生長的菌苔，進(jìn)行生化試驗(yàn)和血清學(xué)分型。宋內(nèi)氏志賀氏菌的單個(gè)菌落直徑大于其他志賀氏菌。 操作步驟 增菌 以無菌操作取檢樣 25 g（ mL），加入裝有滅菌 225 mL 志賀氏菌增菌肉湯的均質(zhì)杯，用旋轉(zhuǎn)刀片式均質(zhì)器以 8 000 r/min～ 10 000 r/min 均質(zhì)；或加入裝有 225 mL志賀氏菌增菌肉湯的均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器連續(xù)均質(zhì) 1 min～ 2 min，液體樣品振蕩混勻即可。 粘液酸鹽培養(yǎng)基。 3 β 半乳糖苷酶培養(yǎng)基。 營養(yǎng)瓊脂斜面。 麥康凱（ MAC）瓊脂。 ℃； e） 電子天平：感量 g； f） 顯微鏡： 10179。 志賀氏菌檢驗(yàn) 1 范圍