【正文】 A甲基化酶 — 用于 DNA分子的甲基化 ? 核酸酶 — 用于 DNA和 RNA的非特異性切割 ? 核酸聚合酶 — 用于 DNA和 RNA的合成 ? 核酸連接酶 — 用于 DNA和 RNA的連接 ? 核酸末端修飾酶 — 用于 DNA和 RNA的末端修飾 ? 其它酶類 — 用于生物細(xì)胞的破壁 ， 轉(zhuǎn)化 ， 核酸純化 ，檢測(cè)等 基因工程中的工具酶 一、限制性內(nèi)切酶 （ 一 ） 、限制修飾系統(tǒng)的種類 （二）、限制性內(nèi)切酶的定義、命名 （三）、限制酶的特點(diǎn) （四）、異源同序酶（ isoschizomer，同裂酶） （五）、限制酶的用途 基因工程中的工具酶 一種限制酶 只 能 識(shí)別一種 特定核苷酸序列 ；并在 特定 切點(diǎn) 切割． 限制性核酸內(nèi)切酶 —— “分子手術(shù)刀” 來(lái)源： 種類： 作用： 主要是微生物 4000種。 上述三個(gè)系統(tǒng)中，只有 II型限制酶與甲基化酶具有相當(dāng)高的核苷酸識(shí)別特異性，因而被廣泛用于基因工程中。 EcoRI— Escherichia coli RI 基因工程中的工具酶 （三）、限制酶的特點(diǎn) 1. 識(shí)別順序和酶切位點(diǎn) １）識(shí)別４ 8個(gè)相連的核苷酸 MboI NGATCN； AvaII GG(A/T)CC BamHI GGATCC： PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC； SfiI GGCC N N N N N GGCC CCGGN’ N’ N’ N’ N’ CCGG ２ ） 富含ＧＣ ３）對(duì)稱性 — 雙對(duì)稱 EcoRI 5’ G A A T T C3’ 3’ C T T A A G5’ ４）切點(diǎn)大多數(shù)在識(shí)別順序之內(nèi)，也有例外 ５）限制酶切后產(chǎn)生兩個(gè)末端，末端結(jié)構(gòu)是５’ Ｐ和３’ ＯＨ 基因工程中的工具酶 2. 末端種類 １）３’ 端突起，個(gè)數(shù)為２或４個(gè)核苷酸 Pst I 5’ CTGCAG3’ 5’ CTGCA G3’ 3’ GACGTC5’ 3’ G ACGTC5’ ２）５’ 端突起，個(gè)數(shù)為２或４個(gè)核苷酸 EcoRI 5’ GAATTC3’ 5’ GOH PAATTC3’ 3’ CTTAAG5’ 3’ CTTAAP HOG5’ 粘性末端能與另一個(gè)相同的粘連末端相連接，任何兩個(gè)具有相同識(shí)別 位點(diǎn)的 DNA分子經(jīng)限制酶切割后能夠重新連接成新的重組 DNA分子。 CTCGAG 基因工程中的工具酶 （四）、異源同序酶（ isoschizomer，同裂酶） 1. 定義 ：能識(shí)別相同序列但來(lái)源不同的兩種或多種限制酶 2. 特點(diǎn) ： 1）識(shí)別相同順序 2）切割位點(diǎn)的異同 KpnI GGTAC C Asp718 G GTACC SstI CCGC GG SacI CCGC GG 基因工程中的工具酶 （五）、 限制酶的用途 1. DNA重組 2. 限制酶（物理）圖譜繪制 3. 突變分析（ RFLP分析） 4. 限制酶的部分酶切與完全酶切 附： IIS型限制酶的特點(diǎn) 1. 具有特異型核苷酸順序識(shí)別能力，但該順序不具有對(duì)稱結(jié)構(gòu)。 5. 均為單體，分子量為 47— 108 kD。 Polymerase Chain Reaction ? Denaturation （ 變性 ） : The target DNA (template) is separated into two stands by heating to 95℃ ? Primer annealing （ 引物退火 ） : The temperature is reduced to around 55℃ to allow the primers to anneal. ? Polymerization (elongation, extension): The temperature is increased to 72℃ for optimal polymerization step which uses up dNTPs and required Mg++ Polymerase Chain Reaction Vectors ? 一、質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性； ? 二、質(zhì)粒 DNA的分離與純化； ? 三、質(zhì)粒載體的構(gòu)建及類型； ? 四、常用質(zhì)粒載體舉例； 一、質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性 （一）、質(zhì)粒 DNA 質(zhì)粒是細(xì)菌染色體外能夠自主復(fù)制的環(huán)形雙鏈的 DNA分子。 質(zhì)粒 DNA不僅能在細(xì)菌中復(fù)制，并且在添加真核復(fù)制信號(hào)和啟動(dòng)子后，可以構(gòu)建出能在原核和真核細(xì)胞中均可復(fù)制的穿梭質(zhì)粒，并在真核細(xì)胞中表達(dá)，因此這類載體在基因工程中應(yīng)用廣泛。因此，作為載體的質(zhì)粒應(yīng)該是松弛型的。 Vectors 二、質(zhì)粒 DNA的分離與純化 Vectors 三、質(zhì)粒載體的構(gòu)建及類型 ? （一）質(zhì)粒載體的發(fā)展概況； ? （二）質(zhì)粒載體的特點(diǎn)（基本條件）； ? （三）遺傳標(biāo)記基因 ? （四）質(zhì)粒載體的類型 Vectors （一）發(fā)展概況 1. 第一階段（ 1977年前）：天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如 pSC101, colE1, pCR, pBR313和 pBR322 (1977, Bolivar et al) 2. 第二階段：增大載體容量（降低載體長(zhǎng)度），建立多克隆位點(diǎn)區(qū)和新的遺傳標(biāo)記基因。 至少應(yīng)有一個(gè)克隆位點(diǎn)，以供外源 DNA插入。 pB R32 2B a m HIS a l IH i n d I I IP s t IS c a I A m pro r i(4. 36 k b) （三）遺傳標(biāo)記基因 標(biāo)記基因的作用 1）指示外源 DNA分子（載體或重組分子） 是否進(jìn)入宿主細(xì)胞 這種指示可以是選擇性的（ Ampr ， Tetr ， Kanr），也可以是非選擇性的（如 lacZ） 2）指示外源 DNA分子 是否插入載體分子 形成了重組子。有的基因是不能用作選擇性標(biāo)記基因（ lacZ等）。Apr抗性基因編碼一種分泌到細(xì)菌細(xì)胞周間質(zhì)的酶，可特異地 切割 氨芐青霉素的 β— 內(nèi)酰胺環(huán)，使氨芐青霉素失活。Kanr等 抗性基因均可使這類抗生素 磷酸化 ，使之不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。這兩個(gè)部分可獨(dú)立存在， 分別由兩個(gè)基因編碼。 β— 半乳糖苷酶基因的優(yōu)點(diǎn) : a. 酶催化