【正文】 8位蘇氨酸，這種抑制作用依然存在[20] 。（圖12）NCatelyticTUBASpacerTail圖12 MARKs的基本結(jié)構(gòu)X射線衍射分析揭示了在MARK活化環(huán)中一些特定殘基可以通過(guò)磷酸化來(lái)影響MARK的活性。圖11 MARK的多種功能[8]. MARK分子特征及調(diào)控MARK在人類(lèi)激酶組（kinome）中屬于Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴(lài)性蛋白激酶（Ca2+calmodulindependent protein kinases, CaMK）家族腺苷單磷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphateactivated protein kinases, AMPK）亞族[1, 3] 。這些位點(diǎn)也可以被其他非脯氨酸導(dǎo)向的激酶磷酸化，例如蛋白激酶A（PKA），蛋白激酶C（PKC），或鈣/鈣調(diào)蛋白依賴(lài)性蛋白激酶II（CaMK II）[14] 。所以MARKs對(duì)tau的磷酸化還會(huì)產(chǎn)生其他多種效應(yīng)。最終聚合形成典型的雙螺旋纖維（paired helical filaments，PHFs），這是在阿爾茨海默癥患者腦中發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)元纏結(jié)的主要成分。在正常成年人大腦組織中tau KXGS基序中262位絲氨酸磷酸化水平很低，但在阿爾茨海默癥病人和胎兒腦中其磷酸化水平提高[9, 10] 。tau與微管的動(dòng)態(tài)相互作用受磷酸化調(diào)控，特別是在tau重復(fù)結(jié)構(gòu)域的KXGS基序的磷酸化，這種基序代表了其微管結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核心。細(xì)胞皮層的微絲網(wǎng)絡(luò)傾向于阻止細(xì)胞形狀發(fā)生大的改變，因此微絲解聚藥物會(huì)促進(jìn)神經(jīng)突的生長(zhǎng)。 MARK的蛋白激酶活性是在研究tau蛋白的病理磷酸化位點(diǎn)時(shí)發(fā)現(xiàn)的，最初是在大鼠腦組織中純化出來(lái)的，被歸類(lèi)為一種蛋白絲氨酸激酶[4, 5] 。這種動(dòng)態(tài)的不穩(wěn)定受許多細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，包括微管結(jié)合蛋白（microtubuleassociated proteins，MAPs），它們又受磷酸化調(diào)節(jié)。我們將編碼MARK13激酶結(jié)構(gòu)域野生型和無(wú)活性突變體的基因插入到pET28aHisTEV原核表達(dá)載體上，通過(guò)Ni2+親和層析和凝膠過(guò)濾層析進(jìn)行目的蛋白的純化。MARKs在細(xì)胞極性決定、胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等多種細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮重要作用。MARKs能夠磷酸化微管結(jié)合蛋白（microtubuleassociated proteins, MAPs）的微管結(jié)合結(jié)構(gòu)域，導(dǎo)致它們從微管上脫離，從而增加微管的運(yùn)動(dòng)性。關(guān)鍵詞：MARKs MAPs PAR1 MST1 MST2 分子克隆 蛋白純化Cloning and purification of catalytic domains of protein kinase MARKsAbstract: Microtubule affinity regulating kinases (MARKs), as a kind of mammalian serine/threonine kinases, are members of the adenosine monophosphateactivated protein kinases (AMPK) subfamily, which belongs to the Ca2+calmodulindependent protein kinases (CaMK) group of kinases. MARKs have vital roles in a variety of cell processes, such as cellular polarity determination, intracellular transport and cell signaling. They can phosphorylate the tubulinbinding domain of microtubuleassociated proteins (MAPs), which causes their detachment from microtubules, and then increases microtubule dynamics. Human MARKs are encoded by four genes to get four isoforms MARK1, MARK2, MARK3 and MARK4. In this research, we focus on the cloning and purification of MARK13 catalytic domains. The gene encoding wild type and inactive mutants of human. MARK13 catalytic domains was constrcuted to the expression vector pET28aHisTEV, and then transformed into condon plus cells. The rebinant proteins are purified by Ni2+ affinity chromatography and gel filtration chromatography.Key words: MARKs MAPs PAR1 MST1 MST2 molecular cloning purification目錄1. 引言 1. 微管、微管結(jié)合蛋白和MARKs 1. MARKs的功能 1. MARK分子特征及調(diào)控 3. PAR1（partitioning defective 1） 4. Hippo，MST1和MST2 5. 選題背景 62. 材料和方法 7. 材料和試劑 7. 質(zhì)粒、菌種和cDNA 7. 常用試劑 7. 常用儀器 8. 方法 9. 從人腦cDNA中擴(kuò)增目的基因片段 9. 目的片段的雙酶切 11. 表達(dá)載體的制備 12. 目的基因與載體的連接 14. 轉(zhuǎn)化大腸桿菌 14. 酶切鑒定與測(cè)序鑒定 15. 突變重組質(zhì)粒的構(gòu)建 17. 轉(zhuǎn)化表達(dá)菌 18. 大量表達(dá) 18. 菌體的破碎 18. Ni2+柱親和層析 18. 脫鹽 19. 酶切回掛 19. 凝膠過(guò)濾層析（分子篩） 203. 結(jié)果與討論 21. 重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果 21. MARK1 45371 WT 蛋白純化結(jié)果 22. Ni2+柱親和層析結(jié)果 22. 酶切回掛后的結(jié)果 23. 凝膠過(guò)濾層析結(jié)果 24. MARK3 41367 K85R 蛋白純化結(jié)果 25+柱親和層析結(jié)果 25. 酶切回掛后的結(jié)果 26. 凝膠過(guò)濾層析結(jié)果 27. 其他四種蛋白純化結(jié)果分析 28. MARK1 45371 K89R 28. MARK2 39364 WT 31. MARK2 39364 K82R 32. MARK3 41367 WT 344. 結(jié)論 35謝辭 36參考文獻(xiàn) 37附錄 41青島大學(xué)本科生畢業(yè)論文1. 引言. 微管、微管結(jié)合蛋白和MARKs. MARKs的功能微管（microtubules，MTs）在細(xì)胞中形成復(fù)雜的微管網(wǎng)絡(luò)，這種微管網(wǎng)絡(luò)在多種細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮重要作用，如在細(xì)胞分化過(guò)程中調(diào)節(jié)細(xì)胞形狀和細(xì)胞極性，有絲分裂過(guò)程中調(diào)控染色體配對(duì)與分離，以及調(diào)控胞內(nèi)運(yùn)輸過(guò)程，而且保證了細(xì)胞的不對(duì)稱(chēng)分裂和形態(tài)發(fā)生。結(jié)構(gòu)MAPs可以促進(jìn)微管蛋白的聚合并穩(wěn)定微管，通常使微管成束存在。tau作為一種微管結(jié)合蛋白主要存在于腦組織中，特別是在是在神經(jīng)元的軸突中，幫助穩(wěn)定微管[6] 。然而，微管為細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程提供核心，因此微管解聚藥物會(huì)阻止神經(jīng)突生長(zhǎng)[7] 。MARK磷酸化tau蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域上的KIGS或KCGS（KXGS基序），特別是第262位絲氨酸和第356位絲氨酸[5] 。研究表明，tau被過(guò)度磷酸化，導(dǎo)致tau從微管上脫離。這種病變也出現(xiàn)在其他神經(jīng)退行性疾病中[3, 11] 。MARKs也磷酸化MAP2和MAP4的KXGS基序，暗示了MARKs作用的一種普遍機(jī)制，在非神經(jīng)細(xì)胞中也發(fā)揮重要作用。MARK除了通過(guò)磷酸化MAPs進(jìn)而影響微管的運(yùn)動(dòng)性來(lái)調(diào)控多種細(xì)胞過(guò)程外，在功能研究過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)了其對(duì)其他一些生命過(guò)程存在一定的影響。與其他激酶相比較，MARK是一種大蛋白,約有720~790個(gè)氨基酸殘基。MARK催化結(jié)構(gòu)域特定殘基的磷酸化會(huì)加強(qiáng)或降低其蛋白激酶活性。另外，MARK的活性可以通過(guò)與其他蛋白的相互作用而被正調(diào)控或負(fù)調(diào)控。）以上的這些活性調(diào)節(jié)都是針對(duì)于MARKs的催化結(jié)構(gòu)域，而其他結(jié)構(gòu)域的調(diào)控也能影響MARKs的活性。[23]所以尋找其上游激酶及潛在的生理相互作用蛋白對(duì)于揭示多種細(xì)胞過(guò)程具有重要意義。當(dāng)Par1基因突變后，線蟲(chóng)在早期發(fā)育時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞不對(duì)稱(chēng)發(fā)育缺陷[25, 28, 29] 。通過(guò)在模式動(dòng)物果蠅中對(duì)PAR1的研究可以進(jìn)一步揭示MARKs在哺乳動(dòng)物中的作用機(jī)制。Hippo途徑由一系列的激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)組成，最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄共激活因子Yorkie（Yki）的活性被抑制。與Yki相互作用的主要轉(zhuǎn)錄因子是Scalloped（Sd）。這兩個(gè)蛋白屬于哺乳動(dòng)物Ste20like（MST）家族生發(fā)中心激酶II（germinal center kinase II, GCKII）亞族，在細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用，它們所涉及的信號(hào)通路包括多種重要的分子，包括RAS，AKT和FOXO3。第二個(gè)是兩個(gè)蛋白都可以在含有hSav的復(fù)合物中檢測(cè)到。Hpo與人的hMST1和hMST2很相似，他們N端的激酶結(jié)構(gòu)域和C末端包含核定位信號(hào)的結(jié)構(gòu)域在人和果蠅中十分保守。如前面所述，與MARKs相互作用主要發(fā)生在MARKs的催化結(jié)構(gòu)域上，所以本論文主要主要截取了MARK13的催化結(jié)構(gòu)域到泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域（UBA）。得到的野生型片段和KR突變片段分別與MST1/2檢測(cè)相互作用強(qiáng)度，檢測(cè)時(shí)加入ATP，若野生型片段可以使MST1/2的激酶活性喪失的突變體發(fā)生磷酸化，而激酶活性喪失的片段不能使MST1/2的激酶活性喪失的突變體發(fā)生磷酸化，則MST1/2很有可能是MARKs的下游磷酸化底物。DH5α克隆菌株Condon Plus 表達(dá)菌株. 常用試劑限制性?xún)?nèi)切酶：EcoRI，XhoI，NotI，NcoI。. 目的基因片段的清潔回收使用北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)的B型小量DNA片段快速純化回收試劑盒進(jìn)行目的片段的清潔回收. 表達(dá)載體的制備本實(shí)驗(yàn)所用的載體為上海生化與細(xì)胞研究所周兆才課題組提供的pET28a改造過(guò)的pET28aHisTEV載體，載體上含有N端Histag，在Histag與多克隆位點(diǎn)之間有TEV酶切位點(diǎn)。圖22 酶切后載體質(zhì)粒片段1%瓊脂糖凝膠電泳圖. 目的基因與載體的連接表210 連接體系連接體系（10μL）：體積目的基因片段載體1μLT4 DNA連接酶T4 DNA連接酶buffer（10）1μL室溫連接2h。冷凍離心機(jī)中6000rpm離心3min，倒掉上清。注意：感受態(tài)最好現(xiàn)做現(xiàn)用，能保證較高的轉(zhuǎn)化效率。（4）將孵育好的菌液6000rpm離心3min，吸去700μL上清后，將剩余的上清與沉淀的菌體充分懸浮，然后涂布于還有卡那霉素的固體LB培養(yǎng)基上。. 重組質(zhì)粒的抽提取2mL菌液，抽提質(zhì)粒。. 測(cè)序鑒定將酶切鑒定結(jié)果正確的樣品菌液送到測(cè)序公司測(cè)序。. 突變重組質(zhì)粒的構(gòu)建. 以正確的野生型片段重組質(zhì)粒為模板，進(jìn)行點(diǎn)突變PCR。由于突變體無(wú)法通過(guò)酶切電泳鑒定，所以只能直接通過(guò)測(cè)序來(lái)鑒定。（3）