【正文】 00S型數(shù)顯電熱恒溫水溫箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；THZ–C型恒溫培養(yǎng)搖床（江蘇太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)儀器廠）；BS210S型電子分析天平（美國(guó)Sartorius公司）；超純水儀（美國(guó)MillionQ公司）。材料與方法一、 實(shí)驗(yàn)材料（一） HSV病毒株序列來(lái)源HSV I gB基因序列來(lái)源于GenBank中的Patton株登錄號(hào)為K03541（二） 生物信息學(xué)分析軟件Anthewin 軟件：能分析、預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的各種特性，繪制蛋白序列的所有理化特性曲線。第一部分HSV I gB抗原表位分析、基因優(yōu)化及真核表達(dá)載體的構(gòu)建抗原表位又叫抗原決定簇，是蛋白質(zhì)抗原性的基礎(chǔ)，負(fù)責(zé)與抗體分子或免疫細(xì)胞表面的抗原受體結(jié)合。技術(shù)路線優(yōu)化合成HSV I gBt基因序列, 以pMCE5作為真核表達(dá)載體，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒gBtpMCE5。而截短后的基因構(gòu)建的疫苗，與用完整基因構(gòu)建的疫苗對(duì)HSV病毒攻擊具有相同的保護(hù)作用[4950]。gB是在感染細(xì)胞中含量最多的蛋白，是感染宿主細(xì)胞免疫和體液免疫的主要靶標(biāo)，也是HSV特定細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)主要靶標(biāo)，CTL對(duì)單皰病毒從原發(fā)感染治愈到預(yù)防潛伏感染的建立起重要作用。小鼠分別接種gB和gD疫苗在體內(nèi)產(chǎn)生高滴度的中和HSV I抗體，并且非常有效地預(yù)防病毒建立潛伏感染，沒(méi)有發(fā)生遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)；小鼠分別接種gC、gE、gI和gH/gL疫苗在體內(nèi)產(chǎn)生中等滴度的中和HSV I抗體，并且有效地預(yù)防病毒建立潛伏感染，發(fā)生強(qiáng)遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)[44]。病毒糖蛋白 (glycoproteins, gp) 是病毒毒粒表面的抗原決定簇，是有包膜病毒表面脂質(zhì)雙層膜的重要成分，其功能關(guān)系到病毒的吸附、進(jìn)入和融合以及抗原性。其優(yōu)點(diǎn)在于能克服由非復(fù)制性抗原所誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫效果較低等難題，因而，即使沒(méi)有有效的佐劑，這種疫苗也能誘導(dǎo)強(qiáng)的細(xì)胞免疫。非致病性的活載體基因工程疫苗是指將非致病性微生物通過(guò)基因工程的方法使之?dāng)y帶并表達(dá)某種特定病原物的抗原決定簇基因，產(chǎn)生免疫原性；或是將致病性微生物通過(guò)基因工程的方法修飾或去掉毒性基因以后，仍保持免疫原性王[3435]。其中以gD和gB尤為重要，它們是HSV主要的免疫原，能誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫，產(chǎn)生高滴度中和抗體，激發(fā)DTH 反應(yīng)及T細(xì)胞增殖反應(yīng)，以gD免疫作用最強(qiáng)[30]。亞單位疫苗是通過(guò)提取或體外合成病毒分泌的蛋白及包膜表面的結(jié)構(gòu)蛋白而制成的一種疫苗，它可以有效避免利用全病原體生產(chǎn)疫苗所導(dǎo)致的生物安全風(fēng)險(xiǎn)，并有利于提高疫苗中有效成分的濃度、純度，以及開(kāi)發(fā)多價(jià)多聯(lián)疫苗[28]。近年來(lái)HSV減毒活疫苗的研究主要集中在特異性地缺失病毒某一基因，使其神經(jīng)毒性減弱，降低其建立潛伏感染的能力等，同時(shí)保持病毒的增殖能力和免疫原性這一目標(biāo)上。但滅活疫苗存在免疫原性弱、不能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生廣泛持久的免疫反應(yīng)、不能確定是否所有病毒均被滅活、裂解的DNA片段潛在致癌的可能性、生產(chǎn)費(fèi)用高等缺點(diǎn)[23] ，并且有潛在致癌性等問(wèn)題[24]。因此，研制和接種HSV疫苗是預(yù)防該病毒感染的理想方法。據(jù)WHO 估計(jì)，每年生殖器皰疹的新發(fā)病例約2 000萬(wàn)。成年人血清中陽(yáng)性率高達(dá)85%以上，某些國(guó)家和地區(qū)甚至達(dá)到100%；HSV II是目前世界上發(fā)生最廣的性傳播疾病，據(jù)估計(jì)全世界有20%人為HSV II陽(yáng)性，并且發(fā)病人數(shù)以約25%的比例逐年增加[1113]。最常見(jiàn)在唇鼻間皮膚與粘膜交界處出現(xiàn)成群的小皰疹。母體在感染HSV II后可通過(guò)產(chǎn)道或密切接觸， 垂直傳染子代新生兒引起皰疹病毒腦炎，死亡率高達(dá)100%[6]。HSV I感染主要引起口唇部皰疹、皰疹性眼角膜炎、皰疹性腦炎等疾病。內(nèi)有核心，核心由核衣殼蛋白包裹，為20面體，有162殼粒。穩(wěn)定高表達(dá)HSV I糖蛋白B細(xì)胞株的建立及表達(dá)蛋白的免疫特性畢業(yè)論文目 錄中文摘要……………………………………………………………………………1英文摘要……………………………………………………………………………3前言…………………………………………………………………………………6技術(shù)路線……………………………………………………………………………11正文…………………………………………………………………………………12第一部分………………………………………………………………………12材料與方法………………………………………………………………12結(jié)果………………………………………………………………………19分析與討論………………………………………………………………23第二部分………………………………………………………………………26材料與方法………………………………………………………………26結(jié)果………………………………………………………………………34分析與討論………………………………………………………………46第三部分………………………………………………………………………50材料與方法………………………………………………………………50結(jié)果………………………………………………………………………52分析與討論………………………………………………………………54小結(jié)……………………………………………………………………………56參考文獻(xiàn)……………………………………………………………………………57文獻(xiàn)綜述……………………………………………………………………………64攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況等……………………………………………………78致謝………………………………………………………………………………79南京醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文前 言單純皰疹病毒 (Herpes simplex virus，HSV) 是人類病毒感染性疾病中最常見(jiàn)的病原體之一。病毒體直徑為120～150nm[1]。HSV II感染主要引起皰疹性陰道炎、新生兒皰疹性腦炎、生殖器皰疹，并且與女性宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)，也是HIV性傳播的重要協(xié)同輔助因素之一[5]。HSV先在感染的組織或接近部位繁殖，構(gòu)成原發(fā)性感染灶，原發(fā)感染產(chǎn)生免疫力后，將大部分病毒清除，部分病毒可沿神經(jīng)髓鞘到達(dá)三叉神經(jīng)節(jié)（HSV I）和脊神經(jīng)節(jié)（HSV II）細(xì)胞中或周圍星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，以潛伏狀態(tài)持續(xù)存在，與機(jī)體處于相對(duì)平衡，不引起臨床癥狀，即潛伏感染。皰疹性角膜炎、皰疹性宮頸炎等亦可反復(fù)發(fā)作[10]。一項(xiàng)數(shù)據(jù)顯示，近年來(lái)我國(guó)的HSV I感染顯著增多，約占HSV感染總?cè)藬?shù)的10%~40%。HSV感染后僅有10%~20%的患者有癥狀[13,15]，而臨床上80% HSV感染者表現(xiàn)為無(wú)癥狀感染或癥狀未被識(shí)別，沒(méi)有癥狀的患者其體內(nèi)的病毒仍然處于激活狀態(tài)，因此70%以上的HSV傳播是由無(wú)癥狀的患者導(dǎo)致的，這也是HSV傳播逐年增加并難以控制的原因[1617]。HSV疫苗按其形成和特點(diǎn)可分為：滅活的全病毒疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗、活載體基因工程疫苗、核酸疫苗、多肽疫苗等[22]。減毒活疫苗是指由活病毒不斷在細(xì)胞中培養(yǎng)繁殖、傳代，直到得到毒力很弱的病毒株。Post和Roizman等以HSV I的F株為原型構(gòu)建的HSV減毒活疫苗就是通過(guò)刪減決定皰疹病毒毒性的基因片段來(lái)制備的，構(gòu)建的這種重組病毒能有效地誘導(dǎo)免疫應(yīng)答[2526]。與傳統(tǒng)滅活疫苗及減毒活疫苗相比，亞單位疫苗具有安全性好、易于生產(chǎn)、可反復(fù)使用而不會(huì)誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生載體抗體等特點(diǎn)。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，亞單位疫苗在保護(hù)機(jī)體抵抗HSV原發(fā)感染和復(fù)發(fā)感染中顯示了良好的安全性和有效性?；钶d體疫苗兼有減毒活疫苗和亞單位疫苗的優(yōu)點(diǎn)，在免疫效力上很有優(yōu)勢(shì)。其他疫苗方面研究包括T細(xì)胞表位多肽疫苗[38]，增強(qiáng)先天免疫反應(yīng)策略[39]，增強(qiáng)免疫反應(yīng)新的傳遞系統(tǒng)[40]等。病毒外膜突起的糖蛋白與易感細(xì)胞受體接觸，相互作用，使病毒吸附于細(xì)胞表面經(jīng)細(xì)胞融合或胞飲進(jìn)入細(xì)胞。目前亞單位疫苗研究的熱點(diǎn)在HSV的gB和gD，研究人員利用DNA 重組技術(shù)，在大腸桿菌、酵母、桿狀病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等多種表達(dá)系統(tǒng)中分別或聯(lián)合表達(dá)這兩種糖蛋白，制成亞單位疫苗，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，它們均能不同程度地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和性抗體，抗體產(chǎn)生水平高低與動(dòng)物遭受病毒感染的程度成正比，還可不同程度地降低動(dòng)物被病毒感染后的發(fā)病率和死亡率[4546]。小鼠接種重組gB蛋白在體內(nèi)產(chǎn)生中和HSV I抗體，對(duì)不同毒株在腹膜內(nèi)或腳蹼接種病毒的免疫試驗(yàn)具有完全保護(hù)作用，與接種減毒活疫苗保護(hù)作用相似，保護(hù)不被大劑量病毒致死，并且抑制潛伏感染和復(fù)發(fā)感染的建立，gB保護(hù)作用具有長(zhǎng)效免疫活性而不是短效作用，明顯保護(hù)三叉神經(jīng)節(jié)免于感染?；趃B攜帶抗原決定簇的數(shù)量、在HSV I感染及誘導(dǎo)機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)中的重要作用，本研究選取HSV I gB作為HSV基因重組亞單位疫苗的候選疫苗。將成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒gBtpMCE5，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，Western blotting鑒定表達(dá)的重組gBt蛋白，多次連續(xù)克隆化，Dot blotting法篩選穩(wěn)定高效表達(dá)的單克隆細(xì)胞株；優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)、表達(dá)方案，收集細(xì)胞表達(dá)上清。同時(shí)，蛋白的表達(dá)水平受多種因素和過(guò)程的影響，基因水平的優(yōu)化對(duì)蛋白質(zhì)的高表達(dá)至關(guān)重要。OptimumGeneTM軟件：專業(yè)的基因優(yōu)化軟件。二、 實(shí)驗(yàn)方法（一） 蛋白抗原性分析應(yīng)用Anthewin 分析軟件分析GenBank中HSV I 型Patton株gB蛋白的氨基酸序列（K03541），針對(duì)氨基酸的抗原性、親水性、疏水性和表面可及性等多個(gè)參數(shù)，對(duì)HSV I gB氨基酸序列進(jìn)行抗原表位的系統(tǒng)分析。g/mL Ampr選擇性LB培養(yǎng)液）3 mL，于12000 rpm離心2 min，棄上清。L Solution II，輕輕顛倒試管混勻4–6次，使菌體充分裂解，形成透明液（此步驟時(shí)間須小于5 min）。（6）將試劑盒中的Spin Column 安置于Collection Tube 上。（9）將700 181。L的滅菌水或Elution Buffer，室溫靜置1 min。目的基因與質(zhì)粒載體的雙酶切選擇兩個(gè)在目的基因和質(zhì)粒載體上均為單一切點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶EcoR I、 Not I分別對(duì)目的基因、質(zhì)粒載體進(jìn)行雙酶切，產(chǎn)生兩個(gè)不同的粘性末端。LBSA 10H Buffer 181。L體系合計(jì) 181。此時(shí)應(yīng)注意盡量切除不含目的DNA部分的凝膠，盡量減小凝膠體積，提高DNA回收率。（4）稱量膠塊重量，計(jì)算膠塊體積。此時(shí)應(yīng)間斷振蕩混合，使膠塊充分融化（約6~10 min，膠塊一定要充分融化，否則將嚴(yán)重影響DNA的回收率。（9）將上述操作7的溶液轉(zhuǎn)移至Spin Column中，12000 rpm離心1 min，棄濾液。（11）將700 181。L的滅菌水或Elution Buffer，室溫靜置1 min。LpMCE5 DNA (EcoR I + Not I) 181。重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化（1）、E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備（氯化鈣法）：①?gòu)?7℃培養(yǎng)16~20 h的新鮮LB平板上挑取一個(gè)單菌落接種到含有3 mL LB培養(yǎng)液的試管中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。④棄上清，每50 mL初始培養(yǎng)物用2 mol/L氯化鈣溶液重懸細(xì)菌沉淀，冰浴30 min或過(guò)夜即可使用。②取出eppendorf管于42℃熱休克90 s后快速將此管轉(zhuǎn)移至冰浴中，使細(xì)胞冷卻2 min。g/mL）選擇性LB培養(yǎng)基平板上，置37℃溫箱培養(yǎng)過(guò)夜。②各取1 mL上述菌液離心收菌，用50 181。L，以PP2為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，每管反應(yīng)體系20181。LP2（下游引物，10 pmol/181。L體系合計(jì) 181。⑤分別取上述PCR產(chǎn)物2181。LBSA 10H Buffer 181。L體系合計(jì) 181。結(jié)果一、 HSV I gB 抗原表位分析：（一） HSV I gB 氨基酸序列（下劃線為胞外區(qū)序列）：MRQGAPARGCRWFVVWALLGLTLGVLVASAAPSSPGTPGVAAATQAANGGPATPAPPALGAAPTGDPKPKKNKKPKNPTPPRPAGDNATVAAGHATLREHLRDIKAENTDANFYVCPPPTGATVVQFEQPRRCPTRPEGQNYTEGIAVVFKENIAPYKFKATMYYKDVTVSQVWFGHRYSQFMGIFEDRAPVPFEEVIDKINAKGVCRSTAKYVRNNLETTAFHRDDHETDMELKPANAATRTSRGWHTTDLKYNPSRVEAFHRYGTTVNCIVEEVDARSVYPYDEFVLATGDFVYMSPFYGYREGSHTEHTSYAADRFKQVDGFYARDLTTKARATAPTTRNLLTTPKFTVAWDWVPKRPSVCTMTKWQEVDEMLRSEYGGSFRFSSDAISTTFTTNLTEYPLSRVDLGDCIGKDARDAMDRIFARRYNATHIKVGQPQYYLANGGFLIAYQPLLSNTLAELYVREHLREQSRKPPNPTPPPPGASANASVERIKTTSSIEFARLQFTYNHIQRHVNDMLGRVAIAWCELQNHELTLWNEARKLNPNAIASATVGRRVSARMLGDVMAVSTCVPVAADNVIVQNSMRISSRPGACYSRPLVSFRYEDQGPLVEGQLGENNELRLTRDAIEPCTVGHRRYFTFGGGYVYFEESAYSHQLSRADITTVSTFIDLNITMLEDHEFVPLEVYTRHEIKDSGLLDYTEVQRRNQLHDLRFADIDTVIHADANAAMFAGLGAFFEGMGDLGRAVGKVVMGIVGGVVSAVSGVSSFMSNPFGALAVGLLVLAGLAAAFFAFRYVMRLQSNPMKALYPLTTKELKNPTNPDASGEGEEGGD