畢業(yè)論文巴西橡膠樹乙烯途徑中抑制因子ein3的western印跡-wenkub
2023-07-08 06:55:39 本頁面
【正文】 政治的穩(wěn)定。此實驗通過刮傷葉片后不同時間的處理后提取葉片蛋白，而后通過特異性乙烯抗體的免疫印跡來檢測刮傷對其乙烯途徑的影響。天然橡膠資源的安全對于國家經(jīng)濟(jì)的安全甚至國家的安全都具有非常重要的意義。經(jīng)常被認(rèn)為是擴(kuò)大種植才引種到其他地方的，但是，病害也是其中很重要的原因。目前，對于天然橡膠的生物合成途徑雖有一定的了解，與橡膠樹合成相關(guān)的一些基因也相繼克隆，并研究它們的一些基本功能，但所報道克隆的cDNA大都用異源同類基因從巴西橡膠樹構(gòu)建的cDNA文庫獲取，從巴西橡膠樹克隆的新基因不多，難以從整體水平上解釋膠乳再生的分子機(jī)制，此外橡膠樹死皮病發(fā)生的分子機(jī)理的相關(guān)研究也有待深入。目前應(yīng)做好做足現(xiàn)有生產(chǎn)技術(shù)執(zhí)行和膠園管理工作，深刻理解領(lǐng)會橡膠樹栽培技術(shù)規(guī)程和割膠技術(shù)規(guī)程，結(jié)合實際情況，制定更為細(xì)致可行的實施細(xì)則，力爭做到科學(xué)合理，穩(wěn)步推進(jìn)我國植膠業(yè)發(fā)展提升。[5] 乙烯對植物的代謝調(diào)節(jié)是貫穿其整個生活周期的。[6]橡膠的割膠也是一種機(jī)械傷害，因此，橡膠割膠后會產(chǎn)生大量的傷害乙烯，增加了依稀的釋放量。[9]大部分與乙烯相關(guān)的生物學(xué)過程都通過核心轉(zhuǎn)錄因子EIN3/EIL1調(diào)控下游的靶基因來實現(xiàn)的。l 4% 40% Acrylamid 250181。l（5）Loading buffer(上樣緩沖液） SDS 10% w/v Glycerol 20% v/v Triscl Bromphend blue % w/v βmerkapto ethanol 10mM（6）Staining buffer(蛋白膠染色液） Methanol(甲醇） 91ml Acetate(冰醋酸） coomassie brilliant blue R250 H2O 91ml Distaining buffer I(蛋白脫色液Ⅰ） Methanol 50% Acetate 10% H2O 40% Distaining buffer II(蛋白脫色液Ⅱ） Methanol 30% Acetate 10% H2O 60%（7）TBST buffer Triscl 50mM Nacl 150mM Tween20 %3方法步驟 在溫室中選取兩株長勢良好且葉片健康的巴西橡膠樹，在兩株橡膠樹上各選取6片葉齡相、無蟲咬痕的幼嫩葉片并標(biāo)記。（處理葉片及取葉片過程中必須戴手套操作且鑷子需經(jīng)過嚴(yán)格消毒） 取處理過的低溫避光保存的葉片放入20度預(yù)冷的陶瓷研缽中加入液氮沿一個方向快速研磨，待其研磨成粉末狀時加入蛋白提取液繼續(xù)研磨一定時間后，吸取沉淀裝入2ml試管中，然后放入95度氣浴鍋中高溫加速提取蛋白10min。Bradford 法法測定蛋白濃度的范圍為31 .25 ～ 2 000 μg/mL。影響B(tài)CA 法測蛋白的主要因素有蔗糖、NH+尿素、EDTA。（3） 在格子中心用移液槍滴加5μl牛血清蛋白和蛋白樣品，每個濃度和樣品各兩個格子，待其自然干燥。（7） 待其風(fēng)干后用剪刀沿染液邊緣剪下放入2ml試管中,%，放入55度氣浴鍋中煮1h。 按照試劑配方配置4%，用移液槍吸取濃縮膠溶液緩慢加入分離膠上面,直至凝膠溶液將要到達(dá)前玻璃板的頂端,插入梳子,凝膠聚合時間約30 min,然后小心拔出梳子,將凝膠放入電泳槽內(nèi),接好電極,將電泳緩沖液加入電泳槽中，,一塊用考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色后脫色觀察對照，另一塊則進(jìn)行轉(zhuǎn)膜后的免疫印跡。 打開電泳儀，將電流調(diào)至15mA，等加入溴酚藍(lán)上樣緩沖液的樣品跑完濃縮膠濃縮成一條粗線進(jìn)入分離膠后將電流調(diào)至30mA進(jìn)行蛋白的分離。染色完成后將膠從染色液中取出放入另一玻璃皿中并加入脫色液I在低轉(zhuǎn)速搖床上脫色30min，棄去脫色液Ⅰ，加入脫色液Ⅱ在相同轉(zhuǎn)速的搖床上脫色過夜。（4）裝板：裝板順序：黑板→海綿→三層濾紙→膠→PVDF膜→三層濾紙→海綿→白板。染色完成后將膠從染色液中取出放入另一玻璃皿中并加入脫色液I在低轉(zhuǎn)速搖床上脫色30min，棄去脫色液Ⅰ，加入脫色液Ⅱ在相同轉(zhuǎn)速的搖床上脫色過夜。 ③封閉糖基：浸入高碘酸鉀溶液中在暗處封閉1h。（8）、二抗孵育與清洗： ①二抗孵育
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