血紅蛋白的提取與分離(1)-wenkub
2023-06-10 18:25:49 本頁(yè)面
【正文】 量不同的蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠時(shí)，相對(duì)分子質(zhì)量 較小的蛋白質(zhì) 容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢；而相對(duì)分子質(zhì)量 較大的蛋白質(zhì) 無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動(dòng)，路程較短，移動(dòng)速度較快。 基礎(chǔ)知識(shí) （一） 凝膠色譜法 凝膠色譜法的 別名： 分配色譜法 是根據(jù)相對(duì)分予質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法。所以對(duì)于一條多肽鏈說(shuō)，至少應(yīng)有的氨基和羧基都是一個(gè) ② 若有個(gè) n氨基酸分子縮和成 m條肽鏈 ,則可形成 n m個(gè)肽鍵 ,脫去個(gè) n m個(gè)水分子，至有氨基和羧基各 m 個(gè) 1相關(guān)計(jì)算 ③ 蛋白質(zhì)可以含有一條或 n條肽鏈、肽鏈通過(guò)化學(xué)鍵（如二硫鍵）互相連接，具有不同的空間結(jié)構(gòu) ④ 關(guān)于蛋白質(zhì)相對(duì)分子量的計(jì)算： n 個(gè)氨基酸形成 m條肽鏈，每個(gè)氨基酸的平均相對(duì)質(zhì)量為 a，那么由此形成的蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量為 n因此，從復(fù)雜的細(xì)胞混合物中提取、分離高純度的蛋白質(zhì)是生物科學(xué)研究中經(jīng)常要做的工作。 蛋白質(zhì)組： 生物個(gè)體表達(dá)的蛋白質(zhì)分子的總和。 生產(chǎn)和生活中使用 酶制劑 和 固定化酶 ，都需要把從微生物細(xì)胞中提取分離出來(lái)。主要是對(duì)蛋白質(zhì)功能的研究 課題 3 血紅蛋白的提取和分離 課題背景 蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)不可缺少的物質(zhì)。 血紅蛋白是人和其他脊椎動(dòng)物紅細(xì)胞的主要組成成分負(fù)責(zé)血液中 O2和 CO2的運(yùn)偷。a (n m) 凝膠 ①性質(zhì)：一些 微小的多孔球體 ， 球 內(nèi)含許多 貫穿的通道； ②化學(xué)本質(zhì)： 多糖類(lèi)化合物： ③實(shí)例： 葡聚糖、瓊脂糖： 凝膠色譜法的 概念： 根據(jù)被分離物質(zhì)的 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的大小， 利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的 分子篩作用， 來(lái)進(jìn)行分離。相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。調(diào)節(jié)緩沖劑的 使用比例 就可以制得在不同 PH范圍內(nèi)使用的緩沖液。 問(wèn)： 在生物化學(xué)的研究工作，為什么要正確配制緩沖溶液和準(zhǔn)確測(cè)定緩沖溶液的 pH？ 閱讀 第 65頁(yè)的相關(guān)內(nèi)容， 回答 以下問(wèn)題： 電泳的概念； 電泳的原理； 電泳的種類(lèi)； SDS的作用。 ③ 電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小，形狀的不同使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。電泳利用了待分離樣品中各種分子（ ）以及分子本身（ ）、（ ）的不同使帶電分子產(chǎn)生不同的（ ），從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。 ③ 原理 基礎(chǔ)知識(shí) （三）電泳 實(shí)例 SDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性。 ⑤ SDS作用機(jī)理 ④ SDS作用 為了消除 靜電荷對(duì)遷移率的影響 可以在凝膠中加入 SDS。 SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì) — SDS復(fù)合物， SDS所 帶負(fù)電荷 的量大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有電荷量。市場(chǎng)上有高分子量、次高分子量及低分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑出售 實(shí)驗(yàn)操作 閱讀 課本相關(guān)內(nèi)容， 思考 以下問(wèn)題： 蛋白質(zhì)的提取和分離一般分成幾步？ 樣品怎樣處理？ 蛋白質(zhì)怎樣分離？ 實(shí)驗(yàn)操作 （一）樣品處理 樣品處理 —— 粗分離 —— 純化 —— 純度鑒定 問(wèn)： 蛋白質(zhì)提取和分離步驟？ 血液 血 漿 水分 固體物質(zhì) 血漿蛋白 無(wú)機(jī)鹽 磷脂 葡萄糖等 血細(xì)胞 白細(xì)胞 血小板 紅細(xì)胞 （最多） 血紅蛋白 （ 90％） 2個(gè) a－肽鏈 2個(gè) β 一肽鏈 4個(gè)亞鐵紅素基團(tuán) ① 血液組成 實(shí)驗(yàn)操作 （一）樣品處理 血液由血漿和各種血細(xì)胞組成，其中紅細(xì)胞最多。血紅蛋白因含有血紅素而呈現(xiàn)紅色。 實(shí)驗(yàn)操作 （一）樣品處理 速度越高和時(shí)間越長(zhǎng)會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等一同沉淀達(dá)不到分離的效果。 實(shí)驗(yàn)操作 （一）樣品處理 血紅蛋白的釋放 將洗滌好的紅細(xì)胞倒入燒杯中，加蒸餾水到原血液的體積，再加 40％體積的甲苯，臵于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?10 min。從上往下數(shù)，第 1層為無(wú)色透明的甲苯層，第 2層為白色薄層固體，是脂溶性物質(zhì)的沉淀層，第 3層是紅色透明液體，這是血紅蛋白的水溶液，第 4層是其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物。 說(shuō)明： 透析袋是一種半透膜，能使小分子自由進(jìn)出，而大分 子不能通過(guò)。 實(shí)驗(yàn)操作 （一）樣品處理 實(shí)驗(yàn)操作 （一）樣品處理 閱讀課本相關(guān)內(nèi)容，了解凝膠色譜的操作過(guò)程。將橡皮塞上部用刀切出鍋底狀的凹穴，將 5 cm長(zhǎng)的一段，插入橡皮塞孔內(nèi)，插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面。 打孔 挖穴 安管 覆網(wǎng) 紗包 插管 注意事項(xiàng)： 底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng)，還會(huì)導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底?！?G”表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍， 75表示凝膠得水值，即每克凝膠膨脹時(shí)吸水 。 實(shí)驗(yàn)操作 （二）凝膠色譜操作 問(wèn) :凝膠的選擇材料 ? G代表意義 ? 簡(jiǎn)單
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