【正文】 境里，減少了培養(yǎng)時(shí)攪拌 對(duì)細(xì)胞的剪切力，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，培養(yǎng)液易于迅速改變，且無(wú)分離細(xì)胞與培養(yǎng)液的困難。胡顯文等將 Cytopore 多孔微載體用于中試規(guī)模的反應(yīng)器，也收到了很好的效果。大孔微載體除了有利于細(xì)胞高密度大規(guī)模培養(yǎng)外，在外源蛋白的長(zhǎng)期高效表達(dá)方面也明顯的優(yōu)勢(shì)。如海藻酸鈉系統(tǒng)、瓊脂糖系統(tǒng)、瓊脂糖 —— 海藻酸鈉系統(tǒng)等。 常用的微珠載體是 DEAE交聯(lián)葡聚糖微粒。另外，這種培養(yǎng)的勞動(dòng)強(qiáng)度減少， 1 升微載體培養(yǎng)生產(chǎn)的細(xì)胞相當(dāng)于 50 個(gè)轉(zhuǎn)瓶 (490cm2/瓶 )所生產(chǎn)的細(xì)胞，省卻了玻璃容器等的清洗和準(zhǔn)備工作。經(jīng)過(guò)幾十年的研究，微載體培養(yǎng)已廣泛地應(yīng)用于動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)，其中尤以Pharmacia 生物技術(shù)公司生產(chǎn)的微載體 (Cytodex、 Cytopore、 Cytoline 等 )使用范圍最廣。這種培養(yǎng)系統(tǒng)具有所占空間小，產(chǎn)物的分離純化比較方便，細(xì)胞保持高度活性等優(yōu)點(diǎn)，適合多種細(xì)胞的培養(yǎng)。培養(yǎng)系統(tǒng)的核心部分由3 至 6 層這樣的中空纖維組成，細(xì)胞接種于中空纖維的外腔?？巳鹂耍?Richard Kncazek）等模擬體內(nèi)微環(huán)境，設(shè)計(jì)了中空纖維細(xì)胞反應(yīng)器。但是，只有極少數(shù)的細(xì)胞適合這種懸浮培養(yǎng)。將采集到的活體組織分散、過(guò)濾、離心、純化、漂洗后接種到適宜的培養(yǎng)液中，置于特定的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。貼壁培養(yǎng)的系統(tǒng)主要有轉(zhuǎn)瓶、中空纖維、玻璃珠、微載體系統(tǒng)等。原來(lái)是圓形的細(xì)胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展成各種形態(tài)，一般在數(shù)天后就鋪滿生長(zhǎng)表面，形成致密的細(xì)胞單層（ monolayer cell）。g/mL。g 鏈霉素。常用的 pH調(diào)整液有 Na2CO3 溶液（ %、 %、 %）、 10%醋酸溶液和 HEPES 液（ 20mmol/L，一種氫離子緩沖劑）。如將 EDTA 和胰蛋白酶溶液按一定的比例混合使用，效果更好。所以用無(wú) Ca2+， Mg2+的溶液配制，消化結(jié)束時(shí)，用血清來(lái)阻制酶作用。不同的細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶的濃度、溫度、作用時(shí)間的要求不一樣。 5．細(xì)胞培養(yǎng)常用液 （ 1）消化液 主要用于細(xì)胞培養(yǎng)前的組織塊解離和細(xì)胞的分散以及傳代培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞脫離貼壁表面并分散細(xì)胞。在細(xì)胞早期培養(yǎng)階段，細(xì)胞對(duì)于無(wú)血清培養(yǎng)基的適應(yīng)性往往是克隆特異性的，每個(gè)新的克隆常需要重新配制培養(yǎng)基和適應(yīng)過(guò)程。動(dòng)物血清成分復(fù)雜，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)易造成污染和毒性作用，不利于產(chǎn)品的純化和檢測(cè)，再加上來(lái)源有限、成本高等限制了它的大規(guī)模使用。 2．合成培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基是參照天然培養(yǎng)基的成分，根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類(lèi)和數(shù)量，用化學(xué)物質(zhì)人工模擬合成的。另外，血清能中和培養(yǎng)基中的有毒物質(zhì)的毒性，使細(xì)胞免受傷害。動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基一般可分為天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基、無(wú)血清培養(yǎng)基幾種，此外，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)還需要一些常用的溶液。 5．營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) 動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與體內(nèi)培養(yǎng)的基本相同，對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求較高，需要多種氨基酸、維生素、輔酶、核酸、嘌呤、嘧啶、激素和生長(zhǎng)因子。因此培養(yǎng)過(guò)程一定要控制 pH，為維持培養(yǎng)液的 pH 恒定，最常用的是加入磷酸緩沖劑的方法。細(xì) 胞代謝隨溫度的降低而減緩，溫度不低于 0℃時(shí)，能抑制細(xì)胞代謝，但細(xì)胞仍能生存和生長(zhǎng)，但速度緩慢。因此，在動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)時(shí)，保持無(wú)污染的環(huán)境是維持細(xì)胞生存的基本條件。這些都給動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)帶來(lái)了一定的難度。雖然動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本原理和微生物細(xì)胞相同，但動(dòng)物細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求更為苛刻，除氨基酸、維生素、鹽類(lèi)、葡萄糖或半乳糖等基本營(yíng)養(yǎng)元素外，還需要血清。再有一類(lèi)是固定化培養(yǎng)，這類(lèi)培養(yǎng)既適用于貼壁依賴(lài)性細(xì)胞，又適用于非貼壁依賴(lài)性細(xì)胞的包埋培養(yǎng)方式，具第 2 頁(yè) 共 22 頁(yè) 有細(xì)胞生長(zhǎng)密度高、抗剪切力和抗污染能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。來(lái)源于血液、淋巴組織的細(xì)胞，許多腫瘤細(xì)胞（包括雜交瘤細(xì)胞）和許多重組細(xì)胞都屬于此類(lèi)細(xì)胞。到了 90 年代初期，世界單克隆抗體的銷(xiāo)售已超過(guò) 30 億美元，取得了明顯的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。 1923 年，法國(guó)學(xué)者卡勒爾設(shè)計(jì)的卡氏培養(yǎng)瓶用于培養(yǎng)雞胚的心肌組織取得成功，也使得多種動(dòng)物組織培養(yǎng)獲得成功。體外培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)（ primary culture，亦稱(chēng)初代培養(yǎng)）和傳代培養(yǎng)（ subculture，亦稱(chēng)繼代培養(yǎng)）。第 1 頁(yè) 共 22 頁(yè) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器 隨著基因工程的發(fā)展，通過(guò)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)所生產(chǎn)出多種療效高的藥物、靈敏的診斷試劑及生物技術(shù)制品，目前在這一方向上正發(fā)展成為一支高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)。原代培養(yǎng)是指從機(jī)體內(nèi)取出的細(xì)胞進(jìn)行初次培養(yǎng)的過(guò)程。 20 世紀(jì) 80 年代以來(lái)，隨著基因工程技術(shù)和細(xì)胞融合技術(shù)的迅速發(fā)展，人們已經(jīng)能夠把特定的外源基因通過(guò) PCR 擴(kuò)增，并轉(zhuǎn)染到動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，得到高質(zhì)量的表達(dá)，由此可生產(chǎn)各種特殊的生物制品。利用人工培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞，可以分離和鑒定病毒，進(jìn)行遺傳工程、代謝及其調(diào)節(jié)方面的研究，并能根據(jù)其表達(dá)產(chǎn)物方面的優(yōu) 點(diǎn)（如轉(zhuǎn)錄后修飾和產(chǎn)物胞外分泌等），生產(chǎn)出許多與人類(lèi)健康和生存密切相關(guān)的生物技術(shù)產(chǎn)品。由于是懸浮生長(zhǎng)，細(xì)胞密度一般都較高，易于大規(guī)模生產(chǎn)，便于過(guò)程的控制。由于所培養(yǎng)的細(xì)胞的不同，固定化培養(yǎng)的方式也有所不同，一般對(duì)于貼壁依賴(lài)性細(xì)胞通常采用膠原包 埋，而對(duì)于非貼壁依賴(lài)性細(xì)胞則常用海藻酸鈣包埋。動(dòng)物細(xì)胞對(duì)于培養(yǎng)環(huán)境的適應(yīng)性更差，對(duì)環(huán)境更加敏感，包括 pH、溶解氧、溫度、剪切力等都比微生物有更高的要求，需要嚴(yán)格控制。 （三）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)條件 1．無(wú)污染環(huán)境 細(xì)胞一旦離開(kāi)機(jī)體，對(duì)環(huán)境無(wú)毒、無(wú)菌的要求也更高。 2．溫度 溫度是細(xì)胞在體外生存的基本條件之一，來(lái)源不同的動(dòng)物細(xì)胞，其最適的生長(zhǎng)溫度是不盡相同的，例如人和哺乳動(dòng)物的體內(nèi)的溫度為 3537℃，昆蟲(chóng)細(xì)胞的最適溫度是 2528℃，培養(yǎng)細(xì)胞的最合適的溫度也在這個(gè)范圍，偏離這一溫度范圍，細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和代謝將會(huì)受到影響，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。 3． pH 值 大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的最適 pH 一般為 ，偏離此范圍對(duì)細(xì)胞將產(chǎn)生有害影響，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致細(xì)胞退變或死亡。 4．溶氧及氣體環(huán)境 細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝離不開(kāi)氣體，所需氣體主要是 O2 和 CO2，氧參與三羧酸循環(huán)，產(chǎn) 生能量供給細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖。大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)滲透壓都有一定的耐受性，對(duì)大多數(shù)細(xì)胞來(lái)說(shuō)，滲透壓在 260320mOsm/kg(每 kg 細(xì)胞耐受的溶質(zhì)濃度為 260320mmol/L)范圍都適宜。 1．天然培養(yǎng)基 即直接取自動(dòng)物體液或從組織中提取的成分做培養(yǎng)基，主要有血漿、血清、胚胎浸出液、鼠尾膠原等。常用的動(dòng)物血清主要有胎牛血清、犢牛血清、小牛血清、人 AB 血清、兔血清等。合成培養(yǎng)基成分已知，便于 實(shí)驗(yàn)條件的控制。無(wú)血清培養(yǎng)基的優(yōu)勢(shì)在于避免了血清的這些缺點(diǎn)。最近研究表明，先使野生型宿主 CHO 細(xì)胞適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞得到的重組克隆在基因擴(kuò)增后保持了在無(wú)血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)中的生長(zhǎng)能力，其產(chǎn)品在生化和結(jié)構(gòu)上類(lèi) 似于未處理的宿主細(xì)胞產(chǎn)物。常用的消化液有胰蛋白酶溶液和二乙烯四乙酸二鈉（ EDTA）溶液。在 ， 37℃時(shí)胰蛋白酶的效果最好。 ② EDTA 溶液：又稱(chēng) Versen，是一種化學(xué)螯合劑，對(duì)細(xì)胞有一定的解離作用。 此外，膠原蛋白酶溶液、鏈酶蛋白酶溶液等也可用于消化細(xì)胞，但價(jià)格昂貴，保存困難，因而使用較少。 （ 3）抗生素液 細(xì)胞培養(yǎng) 的過(guò)程中，需向培養(yǎng)液中加入適量的抗生素液，以防止微生物的污染，而不影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。 ②卡那霉素液：取 5 萬(wàn)微克卡那霉素溶于 50mLHanks 液中，即成 10， 000181。 ③制霉菌素液：因其不溶 于水，將其制成 5， 000181。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到表面相互接觸時(shí)，就停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱(chēng)為接觸抑制（ contact inhibition）。 貼壁培養(yǎng)的一般步驟是，先將組織塊消化，使之分散成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞狀態(tài)，經(jīng)過(guò)濾、離心、純化、漂洗后接種到有適宜營(yíng)養(yǎng)液的培養(yǎng)系統(tǒng)中。傳 代時(shí)不需再分散，只需按比例稀釋即可繼續(xù)培養(yǎng)。 （六）動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù) 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)始于 20 世紀(jì) 60 年代初 Capstick 及其同事為生產(chǎn) FDM 疫苗而對(duì) BHK 細(xì)胞的研究。中空纖維是由聚楓或丙烯的聚合物組成的半透膜，水分子、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氣體可以透過(guò)，細(xì)胞能在表面生長(zhǎng)。細(xì)胞向三維空間繁殖，形成類(lèi)似組織的多層細(xì)胞群體，細(xì) 胞密度可達(dá) 109 個(gè) /ml。 2．微載體培養(yǎng)技術(shù) 大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞，都具有貼壁生長(zhǎng)的特性，而傳統(tǒng)的適于貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，由于表面積的限制，很難達(dá)到大規(guī)模生產(chǎn)的目的。微載體培養(yǎng)是細(xì)胞在由葡聚糖制成的小球表面成單層生長(zhǎng)，通過(guò)輕輕攪拌使細(xì)胞維持懸浮狀態(tài)。而且細(xì)胞與培養(yǎng)液的分離簡(jiǎn)單，一旦攪拌停止， 3 分鐘后細(xì)胞即能依靠其重力而沉淀，只要去除上清液，而無(wú)須進(jìn)行離心操作。近年來(lái)，國(guó)外新開(kāi)發(fā)的 MC 主要有液體微載體、大孔纖維素微載體、 PHEMA 微載體、聚苯乙烯孔微載體 、聚氨酯泡沫微載體、磁性微載體。這類(lèi)技術(shù)能維持很高的細(xì)胞密度，但很難達(dá)到 2L以上的規(guī)模。 大多孔微載體以纖維素為基質(zhì)，內(nèi)部有許多網(wǎng)狀的相互連通的小孔通向載體表面，細(xì)胞在接種后，易于進(jìn)入微載體內(nèi)部生長(zhǎng)分裂，以避免剪切力或氣泡的影響，即使大部分細(xì)胞免受機(jī)械損傷，又為細(xì)胞提供了充分的生長(zhǎng)空間。另外，由聚乙烯和二氧化硅制成的微載體 Cytoline，則適用于貼壁依賴(lài)性及非貼壁依賴(lài)性細(xì)胞的流化床或灌注培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中，微囊化也能提供很高的細(xì)胞密度，產(chǎn)物濃度和細(xì)胞純度都有所增加。將動(dòng)物細(xì)胞和海藻酸溶液混合懸浮，經(jīng)微囊發(fā)生器制成微球滴入氯化鈣溶液中，制成凝膠球。據(jù)報(bào)道，微囊中單抗?jié)舛群芨撸蛇_(dá) ，且無(wú)其它雜蛋白，容易獲得高純度單抗。 在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器是整個(gè)過(guò)程的關(guān)鍵設(shè)備，它要為細(xì)胞提供適宜的生長(zhǎng)環(huán)境并決定著細(xì)胞培養(yǎng)的質(zhì)量和產(chǎn)量。 70年代以來(lái)，細(xì)胞培養(yǎng)用生物反應(yīng)器用很大的發(fā)展，種類(lèi)越來(lái)越多，規(guī)模越來(lái)越大， 但是反應(yīng)器的主要結(jié)構(gòu)形式仍以攪拌式、氣升式和固定床為主。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用生物反應(yīng)器 大致有：氣升式生物反應(yīng)器，中空纖維管生物反應(yīng)器，流化床生物反應(yīng)器，攪拌罐生物反應(yīng)器，堆積床生物反應(yīng)器，一次性生物反應(yīng)器，膜生物反應(yīng)器等 。 戴曉萍等人在氣升式反應(yīng)器中利用微載體培養(yǎng)技術(shù)，研究了 Vero細(xì)胞高密度培養(yǎng)的工藝條件。 （二）中空纖維管生物反應(yīng)器 (hollowfiber bioreactor) 中空纖維細(xì)胞反應(yīng)器主體是由微孔中空纖維管束組成的，纖維束由外殼包裹，因此可分為殼體空間及管體空間兩部分，每部分各有其進(jìn)出口。 中空纖維管細(xì)胞培養(yǎng)裝置的產(chǎn)率與細(xì)胞分泌速度有關(guān)外，還與細(xì)胞培養(yǎng)裝置的設(shè)計(jì)有關(guān)。克瑞克（Ｋnazek） 20 世紀(jì) 70 年代初設(shè)計(jì)的。由此，人們開(kāi)發(fā)出板框式中空纖維反應(yīng)器。該反應(yīng)器內(nèi)有一個(gè)垂直的中央分配管，外面由中空纖維管與分配管呈平行組成一個(gè)環(huán)狀床層。 Guinn發(fā)明了一個(gè)可用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)裝置，由中空纖維反應(yīng)器和灌流系統(tǒng)組成。用泵控制培養(yǎng)介質(zhì)在反應(yīng)器內(nèi)循環(huán)。該反應(yīng)器可用于為大規(guī)模中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)預(yù)測(cè)不同介質(zhì)、培養(yǎng)條件及其他因素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)可能產(chǎn)生的 。這種反應(yīng)器的傳質(zhì)性能好，并在循環(huán)系統(tǒng)中采用膜氣體交換器，能快速提供給高密度細(xì)胞所需要的氧，同時(shí)排出代謝產(chǎn)物；反應(yīng)器中的液體流速足以使細(xì)胞微粒懸浮卻不損壞脆弱的細(xì)胞。 （四）攪拌罐生物反應(yīng)器 (stirtank bioreactor) 第 9 頁(yè) 共 22 頁(yè) 攪拌罐生物反應(yīng)器基本結(jié)構(gòu)為：一個(gè)旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器、一臺(tái)用于控制溫度、 pH 值、攪拌速度和溶氧 (DO)的數(shù)字控制裝置 (DCU)和起通氣作用的底部環(huán)形噴氣結(jié)構(gòu)。它主要的優(yōu)點(diǎn)是能滿足高密度細(xì)胞培養(yǎng)的要求。通過(guò)調(diào)節(jié)氣體混合物的組成成分，完成對(duì) pH 和 DO 的控制，加入氧氣或氮?dú)庖詽M足培養(yǎng)過(guò)程中氧氣的吸收；當(dāng) pH 太高時(shí)加入 CO2；空氣作為一種填充氣體，保持氣體進(jìn)入罐體時(shí)流速的穩(wěn)定。 國(guó)內(nèi)有人采用美國(guó) NEW BRUNS WICK SCIENTIFIC 公司生產(chǎn)的Ｃ elliＧ en Ｐ lus 堆積床生物反應(yīng)器，用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)分泌 rhEPO 的工程細(xì)胞株ＸＰ 9501，用于大規(guī)模生產(chǎn)重組人促紅細(xì)胞生成素。廢氣通過(guò)一個(gè)消毒過(guò)濾器和止逆閥。裝置 簡(jiǎn)單，易于操作，成本低，低剪切力，無(wú)空氣鼓泡，減低了氣泡對(duì)細(xì)胞的損害。植物細(xì)胞含有人類(lèi)所需的成分，而傳統(tǒng)的方法從植物中提取分離這些成分已很難滿足人們的需求。隨著植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)的逐步完善，單細(xì)胞培養(yǎng)的成功，各種新型生物反應(yīng)器的問(wèn)世，利用植物 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)成為大規(guī)模生產(chǎn)植物代謝產(chǎn)物的有效途徑。也可以將不同植物的原生質(zhì)體融合而獲得體細(xì)胞雜交的植株。靜止培養(yǎng)無(wú)需任何設(shè)備，適合某些原生質(zhì)體的培養(yǎng)。與微生物培養(yǎng)相似，植物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)也包括分批培養(yǎng)、半連續(xù)培養(yǎng)（也叫流加培養(yǎng)）、連續(xù)培養(yǎng)三種方式。具體培養(yǎng)方法將在下一節(jié)中介紹。 1．無(wú) 機(jī)鹽類(lèi) 第 11 頁(yè) 共 22 頁(yè) 對(duì)于不同的培養(yǎng)對(duì)象和形式，無(wú)機(jī)鹽的最佳濃度是不相同的。對(duì)常規(guī)的愈傷組織培養(yǎng)和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)來(lái)說(shuō)，硝酸鹽加上銨的濃度可達(dá)到 60mmol/L，說(shuō)明銨可能對(duì)某些培養(yǎng)物有重要作用。 2．碳 源和能源 蔗糖