【正文】 種方法是色譜法中 最常用 的一種方法。工作時，首先將樣品加到色譜柱頭上， 然后用吸附或溶解能力比試樣組分弱得多的氣體或液體作沖洗劑 。固定相呈平板狀的色譜，稱為平板色譜，它又可分為 薄層色譜和紙色譜 。最近，又有一種新分離技術，利用不同組分與固定相（固定化分子）的高專屬性親和力進行分離的技術稱為 親和色譜法 ，常用于蛋白質(zhì)的分離。利用大小不同的分子在多孔固定相中的選擇滲透而達到分離的方法，稱為 凝膠色譜法或尺寸排阻色譜法。利用組分在固定液（固定相）中溶解度不同而達到分離的方法稱為 分配色譜法 。 隨著色譜工作的發(fā)展，通過化學反應將固定液鍵合到載體表面，這種化學鍵合固定相的色譜又稱 化學鍵合相色譜（ CBPC） 。7216。216。80年代以后 出現(xiàn)毛細管電泳和毛細管電動色譜等一系列新的色譜分析方法。這種方法因此得名為 色譜法 。概述 第十四章 色譜法分離原理 第一節(jié) 色譜法是一種重要的分離分析方法，它是根據(jù)組分在兩相中作用能力不同而達到分離目的的。以后此法逐漸應用于無色物質(zhì)的分離， “ 色譜 ” 二字雖已失去原來的含義，但仍被人們沿用至今。4 n在色譜法中，將填入玻璃管或不銹鋼管內(nèi)靜止不動的一相（固體或液體）稱為 固定相 ；n自上而下運動的一相（一般是氣體或液體）稱為 流動相 ；n裝有固定相的管子（玻璃管或不銹鋼管）稱為 色譜柱 。氣體為流動相的色譜稱為 氣相色譜（GC）液體為流動相的色譜稱 液相色譜（ LC） 同理液相色譜亦可分為 液固色譜（ LSC） 和液液色譜（ LLC） 。8216。216。103. 按固定相的外型分類216。114. 按照展開程序分類 按照展開程序的不同，可將色譜法分為 洗脫法 、 頂替法 、 和迎頭法 。由于各組分在固定相上的吸附或溶解能力不同，被沖洗劑帶出的先后次序也不同，從而使組分彼此分離。13167。A B15167。曲線上突起部分就是色譜峰。21 n 色譜流出曲線和色譜峰n 基線（ a）n 峰高（ h）信號進樣 空氣峰 ha色譜流出曲線色譜峰22（四）保留值 tM 不被固定相吸附或溶解的物質(zhì)進入色譜柱時，從進樣到出現(xiàn)峰極大值所需的時間稱為死時間，它正比于色譜柱的空隙體積，如下圖 。 測定流動相平均線速 ū時，可用柱長 L與 tM的比值計算，即保留時間 tR 某組分的保留時間扣除死時間后，稱為該組分的 調(diào)整保留時間 ， 即 tR180。?保留時間是色譜法定性的基本依據(jù)， 但同一組分的保留時間常受到流動相流速的影響，因此色譜工作者有時用保留體積來表示保留值。=式中 保留時間與保留體積關系： VR= tR Fco 30 VR? 某組分的保留體積扣除死體積后，稱為該組分的調(diào)整保留體積。?31 r2,1 某組分 2的調(diào)整保留值與組分 1的調(diào)整保留值之比，稱為相對保留值。tR2=32 在定性分析中，通常固定一個色譜峰作為標準（ s）， 然后再求其它峰（ i） 對這個峰的相對保留值，此時可用符號 ?表示，即 ?/相對保留值往往可作為衡量固定相選擇性的指標，又稱選擇因子。 Y1/2即峰高一半處對應的峰寬。這些峰的寬或窄是由組分在色譜柱中傳質(zhì)和擴散行為決定的，即與色譜過程的動力學性質(zhì)有關。 39 它（ K） 是指在一定溫度和壓力下，組分在固定相和流動相之間分配達平衡時的濃度之比值，即 K=溶質(zhì)在固定相中的濃度 / 溶質(zhì)在流動相中的濃度 Cs41 k 分配比又稱 容量因子 ，它是指在一定溫度和壓力下，組分在兩相間分配達平衡時，分配在固定相和流動相中的物質(zhì)的量比。/=nm42 k值越大，說明組分在固定相中的量越多，相當于柱的容量大，因此又稱 分配容量或容量因子 。 43 k = ns / nm =CsVS / CmVm 式中 cs,cm分別為組分在固定相和流動相的濃度； Vm為柱中流動相的體積，近似等于死體積。 k–/t?RVk 的關系kVS/VM其中 β稱為相比 ，它是反映各種色譜柱柱型特點的又一個參數(shù)。 47Rs若用質(zhì)量分數(shù)表示，即 對組分和流動相通過長度為 L的色譜柱，其所需時間分別為48整理式（ 1814）～（ 1817），可得 49K對 A、 B兩組分的選擇因子，用下式表示：α=t?R/因此兩組分具有不同的分配系數(shù)是色譜分離的先決條件。下圖是 若要使 A、 B組分完全分離，必須滿足以下三點： 52第一 ，兩組分的分配系數(shù)必須有差異；第二 ，區(qū)域擴寬的速率應小于區(qū)域分 離的速度；第三 ，在保證快速分離的前提下，提供足夠長的色譜柱。54小 56 塔板理論假設：1. 在柱內(nèi)一小段長度 H內(nèi)，組分可以在兩相間迅速達到平衡。4. 分配系數(shù)在所有塔板上是常數(shù)，與組分在某一塔板上的量無關。nH n稱為理論塔板數(shù) 。 故 0號板上所含組分總量為 0． 5， 其中氣液（或氣固）兩相 59各為 0． 25,而 1號板上所含總量同樣為0． 5．氣液（或氣固）相亦各為 0． 25。 第二 ，當樣品進入色譜柱后，只要各組分在兩相間的分配系數(shù)有微小差異，經(jīng)過反復多次的分配平衡后，仍可獲得良好的分離。nY1/2)2/與 Y1/2)應采用同一單位（時間或距離）。L/(tRn有效 ==/H有效 n有效 64因為在相同的色譜條件下，對不同的物質(zhì)計算的塔板數(shù)不一樣，因此，在說明柱效時，除注明色譜條件外，還應指出用什么物質(zhì)進行測量。 計算此色譜柱的理論塔板數(shù)。解： (（ 4001600 它用熱力學的觀點 定量說明了溶質(zhì)在色譜柱中移動的速率，解釋了流出曲線的形狀，并提出了計算和評價柱效高低的參數(shù)。但是 ，色譜過程不僅受熱力學因素的影響， 而且還與分子的擴散、傳質(zhì)等動力學因素有關， 因此塔板理論只能定性地給出板高的概念，卻不能解釋板高受哪些因素影響；也不能說明為什么在不同的流速下，可以測得不同的理論塔板數(shù)，因而限制了它的應用。他們吸收了塔板理論中板高的概念，并充分考慮了組分在兩相間的擴散和傳質(zhì)過程，從而在動力學基礎上較好地解釋了影響板高的各種因素。++A 在填充色譜柱中，當組分隨流動相向柱出口遷移時，流動相由于受到固定相顆粒障礙，不斷改變流動方向，使組分分子在前進中形成紊亂的類似渦流的流動，故稱 渦流擴散。2λdpA分子擴散項 （ 縱向擴散項）組分從柱入口加入，其濃度分布的構型呈 “塞子 ”狀。=277 γ是填充柱內(nèi)流動相擴散路徑彎曲的因素， 也稱彎曲因子 ，它反映了固定相顆粒的幾何形狀對自由分子擴散的阻礙情況。因此為降低縱向擴散影響，要加大流動相速度。=這一過程中試樣組分將在兩相間進行質(zhì)量交換，即進行濃度分配。由上式看出，氣相傳質(zhì)阻力與填充物粒度 dp的平方成正比，與組分在載氣流中的擴散系數(shù) Dg成反比。85 液相傳質(zhì)阻力系數(shù) C1為： 由上式看出，固定相的液膜厚度 df薄，組分在液相的擴散系數(shù) D1大，則液相傳質(zhì)阻力就小。雖然提高柱溫可增大 D1， 但會使 k值減小，為了保持適當?shù)?C1值，應控制適宜的柱溫。當流動相流過色譜柱內(nèi)的填充物時，靠近填充物顆粒的流動相流速比在流路中間的稍慢一些，故柱內(nèi)流動相的流速是不均勻。Deemter方程式 可表達為： 根據(jù) van較低線速時， 分子擴散項起主要作用；較高線速時， 傳質(zhì)阻力項起主要作用 ；其中流動相傳質(zhì)阻力項對板高的貢獻幾乎是一個定值。固定相粒度大小對板高的影響當然，固定相顆粒愈細，柱流速愈慢。2/一般說，當 R1時，兩峰有部分重疊；當R=1時，分離程度可達 98% ；當 R=，分離程度可達 % 。通常用 R=分離的標志?！謐2 = 由 （ Y///）（ k / 1+ k）上式即為基本色譜分離方程式。當固定相確定，被分離物質(zhì)對的 α確定后，分離度將取決于 n。分離度與選擇因子的關系α= 這時，無論怎樣提高柱效也無法使兩組