【正文】 (1)影響泳動的首要因素是電泳樣品的物理性質(zhì)：包括電荷多少、分子大小、顆粒形狀和空間結(jié)構(gòu)。堿基上的氨基基團(tuán)解離，而三個(gè)磷酸基團(tuán)中只有第一個(gè)磷酸解離，整個(gè)分子帶正電荷，在電場中向負(fù)極泳動；～，堿基幾乎不解離，磷酸全部解離，核酸分子帶負(fù)電荷，向正極移動?！舅伎碱}】堿法提取質(zhì)粒的原理是什么？【課外閱讀】高純度質(zhì)粒DNA的提取,參閱Qiagen公司說明書,網(wǎng)站:實(shí)驗(yàn)二 質(zhì)粒DNA的電泳和純度檢測實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆誅NA瓊脂糖電泳技術(shù)，了解紫外分光光度法測定DNA濃度和純度的原理。 3．乙醇沉淀DNA離心后，要把離心管四周的上清液抽干或自然揮發(fā)(可將離心管倒置于濾紙上以盡量讓管內(nèi)液體流出)。注意事項(xiàng) 1．該實(shí)驗(yàn)成功的標(biāo)志是把染色體DNA、蛋白質(zhì)與RNA去除干凈，獲得一定得率的質(zhì)粒DNA。 12．加入20μl TE溶解質(zhì)粒DNA，加入RNaseA，終濃度20μg／m1 37℃?！咀⒁狻糠泳哂懈g性，操作時(shí)小心。 4．加入200μl溶液Ⅱ，蓋嚴(yán)管蓋，輕輕顛倒混勻5次，冰浴5min。葡萄糖50mmol／LTrisC1()25mmol／LEDTA10mmol／L3．溶液Ⅱ(新鮮配制)NaOH ／L SDS 1％4．溶液Ⅲ5mol／L KAc60ml冰醋酸水配制好的溶液Ⅲ含3mol／L鉀鹽，5mol／L 醋酸()卡那霉素(Kana): 50mg/ml, 過濾除菌.5．重蒸酚 市售苯酚蒸餾純化(收集179～181℃之間的酚)后，用TE飽和，4℃保存。正確的去除蛋白質(zhì)雜質(zhì)的過程應(yīng)該是酚一酚+氯仿（(1:1)）一氯仿（或氯仿／異戊醇24:1)，處理，根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況也可考慮省略第一或第二步，但切記不可將氯仿（氯仿／異戊醇）的處理步驟省略掉。RNA可用牛胰Rnase A分解除去。當(dāng)溶液的pH調(diào)到大于12時(shí)雙鏈DNA中的氫鍵被破壞，于是染色體DNA的雙鏈分離成單鏈；而超螺旋狀態(tài)的質(zhì)粒DNA僅僅是氫鍵被破壞，并只發(fā)生部分雙鏈解離成單鏈的變化。三種方法比較而言，非離子型去污劑法較溫和，適用于抽提10kb左右的質(zhì)粒；而煮沸法與堿性SDS法相對較劇烈，只能抽提小于10kb的質(zhì)粒。最常用的有利用堿性條件下質(zhì)粒DNA與染色體DNA變復(fù)性的不同進(jìn)行分離的堿法；利用酸性、低離子強(qiáng)度時(shí)超螺旋在水相中，開環(huán)、線型分子在酚相中進(jìn)行分離的酸酚法；利用羥基磷灰石在特定的條件下(8mol／L尿素，／L磷酸緩沖液pH＝)只吸附雙鏈DNA的羥基磷灰石法(在上述條件下染色體DNA均成單鏈，質(zhì)粒DNA保持雙鏈)等。同時(shí)，對于新近產(chǎn)生和應(yīng)用前景廣闊的生物芯片技術(shù)、RNAi技術(shù)和蛋白質(zhì)組研究等，限于我們目前的條件，只能作些演示或作為動態(tài)給以介紹，條件一經(jīng)成熟，即行開設(shè)。而實(shí)驗(yàn)課教材或?qū)嶒?yàn)指導(dǎo)書是開好實(shí)驗(yàn)課的基本條件之一。分子生物學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，在20世紀(jì)下半葉對生命科學(xué)的進(jìn)步產(chǎn)生了舉世公認(rèn)的巨大推動作用，而且對人們的生活和整個(gè)社會的發(fā)展亦產(chǎn)生了巨大的沖擊和影響?！渡锛夹g(shù)大實(shí)驗(yàn)》實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書前 言《生物技術(shù)大實(shí)驗(yàn)》是為生物技術(shù)專業(yè)本科高年級學(xué)生開設(shè)的綜合實(shí)驗(yàn)課程，是在普通生物學(xué)實(shí)驗(yàn)、生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)、微生物實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞生物學(xué)和遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上的綜合實(shí)驗(yàn)課程。分子生物學(xué)技術(shù)已廣泛滲透和應(yīng)用到生物學(xué)、遺傳學(xué)、細(xì)胞學(xué)、微生物學(xué)、進(jìn)化學(xué)、腫瘤學(xué)、免疫學(xué)、藥理學(xué)、發(fā)育學(xué)、病毒學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、生藥學(xué)、法醫(yī)學(xué)等與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)有關(guān)的研究領(lǐng)域。 雖然目前的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教材版本眾多，但針對本科生的生物技術(shù)大實(shí)驗(yàn)教材尚無出版。由于分子生物學(xué)技術(shù)和生物技術(shù)的快速發(fā)展，加之我們是第一次這樣系統(tǒng)地給學(xué)生開設(shè)生物技術(shù)大試驗(yàn)課程，許多工作還處于不斷探索的過程中，難免有不妥和疏漏之處，懇切期望讀者提出寶貴意見，以利不斷修正完善。本實(shí)驗(yàn)選做的是堿法。常用的離子型去污劑是SDS、非離子型去污劑有Triton X100等。再當(dāng)pH調(diào)回中性時(shí)單鏈DNA互相纏繞且與蛋白質(zhì)結(jié)合生成網(wǎng)絡(luò)狀大分子，而超螺旋的質(zhì)粒發(fā)生復(fù)性反應(yīng)后仍是小分子，通過離心的方法很容易將二者分開，達(dá)到分離的目的。蛋白質(zhì)可通過酚、酚／氯仿、氯仿／異戊醇，使蛋白質(zhì)變性劑而除去，同時(shí)，氯仿有強(qiáng)烈的溶脂傾向，對于在除去蛋白質(zhì)的同時(shí)去除脂質(zhì)類雜質(zhì)很有好處。抽提過程完成后的水溶液中仍有痕量的酚、氯仿等，可用乙醇沉淀的方法將它們除去。6．氯仿 異戊醇(24:1)7．無水乙醇8．RNaseA(10mg／ml)9．3mol／L NaAc()10．TE 10mmol／L TrisC1() 1mmoI／L EDTA材料 含有質(zhì)粒(pNTEEGFP, pEGFPN3)的大腸桿菌DH5a.操作步驟 1．挑取瓊脂培養(yǎng)板上的含有pNTEEGFP, pEGFPN3質(zhì)粒的單菌落，接種至5ml LB培養(yǎng)液(含Kana 50μg／m1)，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。 5．加入150μl預(yù)冷的溶液Ⅲ，溫和振蕩10s，冰浴5min。 8．加人等體積氯仿，振蕩混勻，12 000r／min離心2min，上清轉(zhuǎn)移至另一個(gè)Eppendorf管中。13 ％瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后觀察抽提結(jié)果。去掉染色體DNA最為重要，也較困難，因?yàn)樵谌刻崛∵^程中，只有一次機(jī)會去除染色體DNA，其關(guān)鍵步驟是加入溶液Ⅱ與溶液Ⅲ時(shí)，控制變性與復(fù)性操作時(shí)機(jī)，既要使試劑與染色體DNA充分作用使之變性，又要使染色體DNA不斷裂解成小片段，從而能與質(zhì)粒DNA相分離。否則，用TE緩沖液溶解DNA時(shí)，既困難又不完全。實(shí)驗(yàn)原理：帶電荷的物質(zhì)在電場中的趨向運(yùn)動稱為電泳。不同大小和構(gòu)象的核酸分子的電荷密度大致相同，在自由泳動時(shí)，各核酸分子的遷移率區(qū)別很小，難以分開。一般來說顆粒帶電荷的密度愈大，泳動速率愈快；顆粒物理形狀愈大，與支持物介質(zhì)摩擦力越大，泳動速度越小。三者之間的遷移速率，一般為Ⅰ型Ⅲ型Ⅱ型，但是有時(shí)也會出現(xiàn)相反的情況，因?yàn)榕c瓊脂糖濃度、電流強(qiáng)度、離子強(qiáng)度及溴乙錠染料含量有關(guān)。瓊脂糖凝膠的孔徑大，可以分離長度為100bp至近60kb的DNA分子；聚丙烯酰胺凝膠的孔徑小，可分離小片段(5～500bp)DNA，效果最好。在低電壓時(shí)，線性DNA分子的泳動率與電壓成正比。由于Cl—的泳動速度比樣品分子快得多，易引起帶型不均一現(xiàn)象，所以常利用TAE、TBE和TPE三種緩沖體系。2．指示劑 電泳過程中，常使用一種有顏色的標(biāo)記物以指示樣品的遷移過程。3．染色劑 核酸需經(jīng)過染色才能顯示出帶型，最常用的是溴乙錠染色法。／m1的EB溶液染色1015min后進(jìn)行紫外觀察，由于EB在可見光下易分解，故應(yīng)存棕色瓶中于4℃條件下保存。(3)10mg／ml溴乙錠溶液。2．器材(1)恒溫水浴(2)電泳槽(3)電泳儀(4) 微波爐(5)紫外線檢測儀(6)移液器；1001000μl， 10100μl,操作步驟電泳(1) g瓊脂糖，加入100ml 1TAE電泳緩沖液中。室溫下15～30min后，瓊脂糖溶液完全凝固。(8) 取5μl實(shí)驗(yàn)一制備的質(zhì)粒DNA，在DNA樣品中加入1／10的上樣緩沖液并混勻。注意：長度以兩個(gè)電極之間的距離計(jì)算。2 換算出OD260/OD280的比值，較純的DNA。106 Dalton1 OD260nm=40mg附錄二、瓊脂糖凝膠濃度與線性DNA的最適分辨范圍瓊脂糖凝膠濃度線性DNA的最適分辨范圍（bp）%%%%%%1，00030,00080012,0005001,0004007,0002003,000502,000實(shí)驗(yàn)三 PCR產(chǎn)物的TA克隆實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆胀ㄟ^TA連接克隆PCR產(chǎn)物的原理和方法。 下圖是大連寶生物公司的T載體及其說明書。端添加“T”而成。此外，本制品中的高效連接液Ligation Solution I 可以在極短的時(shí)間內(nèi) (30分鐘1小時(shí)) 完成連接反應(yīng)，大大地方便了實(shí)驗(yàn)操作。α互補(bǔ)和藍(lán)白篩選的原理：許多載體（包括pMD18T）都具有一段大腸桿菌β半乳糖苷酶的啟動子和編碼其N端氨基酸（α肽鏈）的片斷基因。當(dāng)外源DNA片斷插入到多克隆位點(diǎn)后，就會破壞α肽鏈的閱讀框，從而不能合成與受體菌內(nèi)的β半乳糖苷酶相互補(bǔ)的活性α肽鏈，而導(dǎo)致不能形成功能活性的β半乳糖苷酶，因此含有重組質(zhì)粒載體的克隆往往是白色的，而沒有插入外源片斷的則是藍(lán)色的。操作步驟1. 在微型離心管中制備下述連接反應(yīng)液，全量為10 ml。3. 全量 (10ml) 轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細(xì)胞 (100 ml)中。注意事項(xiàng)：1. Ligation Solution I 請于冰中融解。4. 按照本實(shí)驗(yàn)操作進(jìn)行連接后，直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)的連接液不要超過20 ml。7. 感受態(tài)細(xì)胞可使用適合于pUC系列載體的感受態(tài)細(xì)胞，如：JM109，DH5a等。一般情況下，大片段DNA的克隆效率（連接效率與轉(zhuǎn)化效率）小于短片段DNA，在使用大片段DNA的連接液進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)，建議采用電轉(zhuǎn)化方法。2. PCR產(chǎn)物中短片段雜質(zhì)DNA太多，這時(shí)應(yīng)切膠回收純化DNA片段，回收時(shí)PCR產(chǎn)物不要在紫外線下暴露時(shí)間過長。6. 最好使用新配制的平板培養(yǎng)基。 實(shí)驗(yàn)四 感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞的制備 實(shí)驗(yàn)五 重組DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 掌握CaCl2制備感受態(tài)大腸桿菌的方法和化學(xué)轉(zhuǎn)化法。轉(zhuǎn)化效率是衡量菌體處于感受態(tài)的細(xì)胞多少的指標(biāo)，一般定義為1μg環(huán)狀質(zhì)粒DNA在感受態(tài)細(xì)胞過量的情況下產(chǎn)生轉(zhuǎn)化子的個(gè)數(shù)。②CaCl2法0℃放置時(shí)間的影響：細(xì)菌經(jīng)0℃ CaCl2處理后轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間的推移而增加，24h達(dá)到最高，之后轉(zhuǎn)化率逐漸下降。⑤菌株基因型recA+與recA—的影響：recA基因是rec系列中最主要的基因，編碼同源重組蛋白。 3．100mmol／L CaCl2，用純水配制。 7．培養(yǎng)皿及1．5ml離心管等。 4. 沉淀的菌體懸浮于20m1 ／L冷CaCl2內(nèi)，冰浴中放置30min，4℃4000r／min離心8 min。 9．。平板在37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。3．42℃熱處理時(shí)間很關(guān)鍵，轉(zhuǎn)移速度要快，且溫度要準(zhǔn)確，同時(shí)注意熱處理過程中離心管不要搖動。實(shí)驗(yàn)原理 PCR(polymerase chain reaction)是在體外進(jìn)行的由引物介導(dǎo)的酶促DNA擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)由一系列的變性——退火——延伸反復(fù)循環(huán)構(gòu)成，即在高溫下模板雙鏈DNA變性解鏈，然后在較低的溫度下同過量的引物退火，再在適中的溫度下由DNA聚合酶催化進(jìn)行延伸。合適的引物選擇應(yīng)需考慮到以下因素，如Taq酶的最適溫度(TE)和Tm值等。所以Ta的選擇應(yīng)滿足TE25℃TaTE。當(dāng)然若要在引物的5＇末端加上特定的酶切位點(diǎn)等堿基則可稍長。 4．引物3′端起始堿基 Taq酶在3′末端錯(cuò)配時(shí)延伸效率是不一樣的，延伸效率為TG＝CA。 5．引物無發(fā)卡結(jié)構(gòu) 引物自身應(yīng)無發(fā)卡結(jié)構(gòu)。7．二引物的Tm值 引物設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)注意使二引物的Tm值相近，否則二個(gè)引物必然不能同時(shí)達(dá)到最佳退火溫度，將會影響PCR擴(kuò)增效果。由試劑公司與Taq酶一起提供。dNTP的用量與PCR產(chǎn)量及產(chǎn)物忠實(shí)性有關(guān)，dNTP量過少時(shí)合成的產(chǎn)物減少。 (4)pH值：PCR反應(yīng)中用的是TrisHCL緩沖系統(tǒng)。如5mmol／L的二硫蘇糖醇(DTT)，100μg／ml的小牛血清白蛋白(BSA)％的明膠。每個(gè)PCR反應(yīng)中加入的模板數(shù)量可在102～105分子之間，必要時(shí)可低至50個(gè)分子，模板的量少時(shí)應(yīng)酌情增加循環(huán)次數(shù)。隨著引物濃度的降低，PCR反應(yīng)的特異性提高但產(chǎn)物得率降低；隨著引物濃度的升高，情況正好相反。2．試劑（1）50TAE電泳緩沖液（2）10PCR緩沖液：（3）4種dNTP混和液10mmol/L（4）Pfu DNA聚合酶（5U/μl）（5）引物（20μM）（6）10溴酚藍(lán)上樣緩沖液方法和步驟1. 在PCR儀上設(shè)置好程序。（用舊式的PCR儀進(jìn)行基因擴(kuò)增時(shí)還要求覆蓋約50μl (一滴)液體石蠟油，改進(jìn)后的PCR儀已經(jīng)不用液體石蠟油覆蓋。+對Taq DNA聚合酶的活性影響很大，有時(shí)按照試劑商提供的說明擴(kuò)增不出目的基因時(shí)，不妨適當(dāng)增加Mg2+的濃。 1．低熔點(diǎn)膠法 低熔點(diǎn)膠是向普通瓊脂糖的多糖鏈上引入羥乙基形成的，這一變化會使凝膠的熔化點(diǎn)與凝固點(diǎn)均降低。低熔點(diǎn)膠的另一個(gè)特點(diǎn)是電泳回收后可以立即進(jìn)行酶切連接、標(biāo)記等酶反應(yīng)，因?yàn)檫@類膠中不含有普通瓊脂糖中抑制酶活性的硫酸鹽等雜質(zhì)，并且收集的膠條能在酶反應(yīng)的合適溫度(37℃)始終保持液體狀態(tài)?！?kb的小分子片段，均有80％的回收率?；驹硎?，在高鹽狀態(tài)下，純化樹脂專一性地吸附DNA；而在低鹽或水溶液狀態(tài)下，DNA被洗脫下來。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容試劑與器材 試劑 (1)瓊脂糖 (2)TAE電泳緩沖液 (3)10DNA電泳樣品緩沖液 (4)無菌水 (5)PCR產(chǎn)物(6)溴化乙錠（EB）（7）試劑盒包裝及組成純化樹脂 （于GS結(jié)合液中）20ml離心純化柱（空柱子）50套（8）80%異丙醇或80%乙醇 （9）超純水或TE緩沖液儀器(1)臺式高速離心機(jī)(2)水浴鍋13(3)電泳器材實(shí)驗(yàn)步驟 1. 將無石蠟油的PCR反應(yīng)液或酶切反應(yīng)液（50μl~100181。盡量切掉不含DNA的瓊脂糖凝膠，這樣可簡化操作、提高回收量及DNA片段的質(zhì)量。 對于高濃度的瓊脂糖凝膠（2%），加熱融膠的時(shí)間延長到15分鐘。 4. 加入500181。重復(fù)第4步一次，此步驟13,000rpm離心2分鐘，務(wù)必將異丙醇 （或乙醇）除盡。l TE緩沖液（若用于測序，則加40181。TE緩沖液或超純水的用量視用戶對濃度的要求而定。l