【正文】 ），以提高鍵合相的穩(wěn)定性。A．鍵合相的性質(zhì)目前，化學(xué)鍵合相廣泛采用微粒多孔硅膠為基體，用烷烴二甲基氯硅烷或烷氧基硅烷與硅膠表面的游離硅醇基反應(yīng)，形成SiOSiC鍵形的單分子膜而制得。因此，聚合物基質(zhì)廣泛用于分離大分子物質(zhì)。所有聚合物基質(zhì)在流動(dòng)相發(fā)生變化時(shí)都會(huì)出現(xiàn)膨脹或收縮。苯乙烯二乙烯苯基質(zhì)疏水性強(qiáng)。它也是剛性的，不會(huì)在溶劑中收縮或膨脹。硅膠可分為無定形全多孔硅膠和球形全多孔硅膠，前者價(jià)格較便宜，缺點(diǎn)是渦流擴(kuò)散項(xiàng)及柱滲透性差；后者無此缺點(diǎn)。在液固吸附色譜法中，硅膠的含水量越小，其表面硅醇基的活性越強(qiáng)，對溶質(zhì)的吸附作用越大。在液固吸附色譜法中，硅膠的比表面積越大，溶質(zhì)的k值越大。硅膠的主要性能參數(shù)有：①平均粒度及其分布。除具有高強(qiáng)度外，還提供一個(gè)表面，可以通過成熟的硅烷化技術(shù)鍵合上各種配基，制成反相、離子交換、疏水作用、親水作用或分子排阻色譜用填料。無機(jī)物基質(zhì)剛性大，在溶劑中不容易膨脹。固定相和流動(dòng)相在色譜分析中，如何選擇最佳的色譜條件以實(shí)現(xiàn)最理想分離，是色譜工作者的重要工作，也是用計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)HPLC分析方法建立和優(yōu)化的任務(wù)之一。e．排阻色譜法　固定相是有一定孔徑的多孔性填料，流動(dòng)相是可以溶解樣品的溶劑。另外高氯酸、三氟乙酸也可與多種堿性樣品形成很強(qiáng)的離子對。d．離子對色譜法　又稱偶離子色譜法，是液液色譜法的分支。被分離組分在離子交換柱中的保留時(shí)間除跟組分離子與樹脂上的離子交換基團(tuán)作用強(qiáng)弱有關(guān)外，它還受流動(dòng)相的pH值和離子強(qiáng)度影響。正相色譜法與反相色譜法比較表正相色譜法 反相色譜法固定相極性 高～中 中～低流動(dòng)相極性 低～中 中～高組分洗脫次序 極性小先洗出 極性大先洗出從上表可看出，當(dāng)極性為中等時(shí)正相色譜法與反相色譜法沒有明顯的界線（如氨基鍵合固定相）。隨著柱填料的快速發(fā)展，反相色譜法的應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大，現(xiàn)已應(yīng)用于某些無機(jī)樣品或易解離樣品的分析。常用于分離中等極性和極性較強(qiáng)的化合物(如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。由于涂布式固定相很難避免固定液流失，現(xiàn)在已很少采用。常用于分離同分異構(gòu)體。a．液固色譜法　使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離原理是根據(jù)固定相對組分吸附力大小不同而分離。靈敏度高—。高靈敏度—。色譜柱每米降壓為75 kg/cm2以上。它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會(huì)引起高阻力，需用高壓輸送流動(dòng)相，故又稱高壓液相色譜法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。色譜法最早是由俄國植物學(xué)家茨維特（Tswett）在1906年研究用碳酸鈣分離植物色素時(shí)發(fā)現(xiàn)的，色譜法(Chromatography)因之得名。(此外還有電泳)。液相色譜法適用于分離低揮發(fā)性或非揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)。LabAlliace高效液相色譜系統(tǒng)培訓(xùn)教材一、液相色譜系統(tǒng)的基本原理 色譜法分類按兩相的物理狀態(tài)可分為：氣相色譜法(GC)和液相色譜法(LC)。LC同樣可分為液固色譜法(LSC)和液液色譜法(LLC)。按操作形式可分為紙色譜法(PC)、薄層色譜法(TLC)、柱色譜法。后來在此基礎(chǔ)上發(fā)展出紙色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法。又因分析速度快而稱為高速液相色譜法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。高速—~ ml/min。同時(shí)消耗樣品少。柱子可反復(fù)使用—用一根色譜柱可分離不同的化合物。分離過程是一個(gè)吸附－解吸附的平衡過程。b．液液色譜法　使用將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔(dān)體表面，或化學(xué)鍵合于擔(dān)體表面而形成的固定相，分離原理是根據(jù)被分離的組分在流動(dòng)相和固定相中溶解度不同而分離?，F(xiàn)在多采用的是化學(xué)鍵合固定相，如C1C氨基柱、氰基柱和苯基柱。反相色譜法　一般用非極性固定相（如C1C8）；流動(dòng)相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機(jī)溶劑以調(diào)節(jié)保留時(shí)間。為控制樣品在分析過程的解離，常用緩沖液控制流動(dòng)相的pH值。c．離子交換色譜法　固定相是離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形成的聚合物骨架，在表面未端芳環(huán)上接上羧基、磺酸基（稱陽離子交換樹脂）或季氨基（陰離子交換樹脂）。pH值可改變化合物的解離程度，進(jìn)而影響其與固定相的作用。它是根據(jù)被測組分離子與離子對試劑離子形成中性的離子對化合物后，在非極性固定相中溶解度增大，從而使其分離效果改善。分析酸性物質(zhì)常用四丁基季銨鹽，如四丁基溴化銨、四丁基銨磷酸鹽。小分子量的化合物可以進(jìn)入孔中，滯留時(shí)間長；大分子量的化合物不能進(jìn)入孔中，直接隨流動(dòng)相流出。本節(jié)著重討論填料基質(zhì)、化學(xué)鍵合固定相和流動(dòng)相的性質(zhì)及其選擇。有機(jī)聚合物基質(zhì)主要有交聯(lián)苯乙烯二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯。硅膠基質(zhì)填料適用于廣泛的極性和非極性溶劑。②平均孔徑及其分布。④含碳量及表面覆蓋度（率）。⑥端基封尾。⑧硅膠純度。但與硅膠不同的是，氧化鋁鍵合相在水性流動(dòng)相中不穩(wěn)定。使用任何流動(dòng)相，在整個(gè)pH范圍內(nèi)穩(wěn)定，可以用NaOH或強(qiáng)堿來清洗色譜柱。用于HPLC的高交聯(lián)度聚合物填料，其膨脹和收縮要有限制。B．基質(zhì)的選擇硅膠基質(zhì)的填料被用于大部分的HPLC分析，尤其是小分子量的被分析物，聚合物填料用于大分子量的被分析物質(zhì)，主要用來制成分子排阻和離子交換柱。硅膠表面的硅醇基密度約為5個(gè)/nm2，由于空間位阻效應(yīng)（不可能將較大的有機(jī)官能團(tuán)鍵合到全部硅醇基上）和其它因素的影響，使得大約有40~50%的硅醇基未反應(yīng)。另一方面，也有些ODS填料是不封尾的，以使其與水系流動(dòng)相有更好的“濕潤”性能。pH值對以硅膠為基質(zhì)的鍵合相的穩(wěn)定性有很大的影響，一般來說，硅膠鍵合相應(yīng)在pH=2~8的介質(zhì)中使用。極性鍵合相有時(shí)也可作反相色譜的固定相。另外C18柱穩(wěn)定性較高，這是由于長的烷基鏈保護(hù)了硅膠基質(zhì)的緣故，但C18基團(tuán)空間體積較大，使有效孔徑變小，分離大分子化合物時(shí)柱效較低。二醇基鍵合相適用于分離有機(jī)酸、甾體和蛋白質(zhì)。短鏈烷基鍵合相能用于極性化合物的分離，而苯基鍵合相適用于分離芳香化合物。因此，k值是流動(dòng)相組成的函數(shù)。堿性流動(dòng)相不能用于硅膠柱系統(tǒng)。③必須與檢測器匹配。高粘度溶劑會(huì)影響溶質(zhì)的擴(kuò)散、傳質(zhì)，降低柱效，還會(huì)使柱壓降增加，使分離時(shí)間延長。⑥樣品易于回收。正相色譜的流動(dòng)相通常采用烷烴加適量極性調(diào)整劑。但Snyder則推薦采用乙腈水系統(tǒng)做初始實(shí)驗(yàn)，因?yàn)榕c甲醇相比，乙腈的溶劑強(qiáng)度較高且粘度較小，并可滿足在紫外185~205nm處檢測的要求，因此，綜合來