【正文】 出汽閥門直至 121℃ （ 表壓 ） 開始保溫 ， 保溫一般為30 min。 第一節(jié) 滅菌 在進(jìn)行培養(yǎng)基滅菌之前 ， 通常先把發(fā)酵罐的空氣分過濾器滅菌并用空氣吹干 。 將培養(yǎng)基在配料罐中配制好 ， 通過專用管道用泵輸送到發(fā)酵罐 ， 開始滅菌 。 在實(shí)驗(yàn)室 ， 由于培養(yǎng)基量較少而采用的滅菌鍋滅菌也是分批滅菌 。 如果將全部微生物作為耐熱的細(xì)菌芽孢來考慮 ， 雖然會(huì)延長滅菌時(shí)間或提高滅菌溫度 ， 但滅菌效果得到了保證 。 因此培養(yǎng)基的滅菌一般都采用高溫短時(shí)間加熱的方式 ， 這樣可以達(dá)到徹底滅菌和把營養(yǎng)成分的破壞減少到最低限度的目的 。如硬脂嗜熱芽孢桿菌 FS1518在 104℃ 下 k值為 ，121℃ 時(shí) k值為 ， 而 131℃ 時(shí) k值則為 15min1， 可見提高滅菌溫度 ， k值增大 ， 滅菌時(shí)間顯著縮短 。 第一節(jié) 滅菌 上述式中的反應(yīng)速率常數(shù) k是微生物耐熱性的一種特征 ， 它隨微生物的種類和滅菌溫度的變化而變化 。 將存活率 Nt/N0對(duì)時(shí)間 t在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)上繪圖 ， 可得到一條直線 ， 其斜率的絕對(duì)值就是比死亡速率常數(shù) k。 微生物受熱死亡主要是由微生物細(xì)胞內(nèi)酶蛋白受熱凝固變性所致 。 熱阻是指微生物在某一特定條件 （ 主要是溫度和加熱方式 ） 下的致死時(shí)間 。 在致死溫度下 ，殺死全部微生物所需要的時(shí)間稱為致死時(shí)間 。而芽孢細(xì)菌的芽孢能經(jīng)受較高的溫度 ， 在 100℃ 下要經(jīng)過數(shù)分鐘甚至數(shù)小時(shí)才能殺死 。 第一節(jié) 滅菌 二 、 培養(yǎng)基的滅菌 由于培養(yǎng)基的滅菌大多數(shù)采用濕熱方法滅菌 ， 所以這里介紹培養(yǎng)基的濕熱滅菌 。 對(duì)于熱敏性培養(yǎng)基也采用過濾方法實(shí)驗(yàn)除菌 。 一般的濕熱滅菌條件是 121℃ ， 30min。 第一節(jié) 滅菌 4． 濕熱滅菌 濕熱滅菌就是指利用飽和水蒸汽進(jìn)行滅菌 。 今年來 ， 微波滅菌設(shè)備的興起 ， 為滅菌提供了新的選擇 。 紫外線對(duì)芽孢和營養(yǎng)細(xì)胞都能起作用 ， 但細(xì)菌芽孢和霉菌孢子對(duì)紫外線的抵抗力較強(qiáng) 。 常用的化學(xué)藥劑有甲醛 、 氯 （ 或次氯酸鈉 ） 、 高錳酸鉀 、 環(huán)氧乙烷 、 季銨鹽 （ 或新潔爾滅 ） 、 臭氧等 。滅菌與空氣凈化 第四章 滅菌與空氣凈化 第一節(jié) 滅菌 第二節(jié) 空氣凈化 第一節(jié) 滅菌 一 、 常見滅菌方法 滅菌是指利用物理或化學(xué)方法殺滅或除去物料及設(shè)備中一切生命物質(zhì)的過程 ， 比消毒的要求更加嚴(yán)格 。 由于化學(xué)藥劑也會(huì)與培養(yǎng)基中的一些成分作用 ， 而且加入培養(yǎng)基后不易去除 ， 所以化學(xué)滅菌法一般不用于培養(yǎng)基的滅菌 ， 適用于車間環(huán)境的滅菌 ， 接種操作前小型器具的滅菌等 。 紫外線的穿透力較低 ， 僅適用于表面滅菌和無菌室 、 培養(yǎng)室等空間的滅菌 ， 對(duì)固體物料滅菌不徹底 ， 也不能用于液體物料的滅菌 。 第一節(jié) 滅菌 3． 干熱滅菌 干熱滅菌是指利用高溫 ， 導(dǎo)致微生物細(xì)胞發(fā)生氧化 ，微生物體內(nèi)蛋白質(zhì)發(fā)生變性和電解質(zhì)濃縮引起中毒等作用 ，氧化作用導(dǎo)致微生物死亡是主要依據(jù) 。 由于蒸汽具有很強(qiáng)的穿透能力 ， 而且在冷凝時(shí)能釋放出大量的熱能 ，易使微生物細(xì)胞中的蛋白質(zhì) 、 酶和核酸分子內(nèi)部的化學(xué)鍵 ，特別是氫鍵受到破壞 ， 引起不可逆轉(zhuǎn)的變性 ， 導(dǎo)致微生物死亡 。 第一節(jié) 滅菌 5． 過濾除菌 過濾除菌就是利用過濾方法截留微生物 ， 達(dá)到除菌的目的 。 在產(chǎn)品過程中 ， 也可利用無菌過濾方法來處理料液 ， 以獲得無菌產(chǎn)品 。 1． 微生物的死亡速率與理論滅菌時(shí)間 （ 1） 微生物的熱阻 每一種微生物都有一定的最適生長溫度范圍 ， 存在一個(gè)最低限和最高限 ， 當(dāng)微生物處于最低限溫度以下時(shí) ， 處于休眠狀態(tài) 。 某些嗜熱菌芽孢能在 120℃下耐受 20～ 30min， 但這種菌在培養(yǎng)基中出現(xiàn)的機(jī)率較低 。 在致死溫度以上 ， 溫度越高 ， 致死時(shí)間越短 。 相對(duì)熱阻是指某一微生物在某條件下的致死時(shí)間與另一微生物在相同條件下的致死時(shí)間的比值 ， 表 41是幾種微生物對(duì)濕熱的相對(duì)抵抗力 。 在一定溫度下 ，微生物受熱后其死亡細(xì)胞的個(gè)數(shù)的變化如化學(xué)反應(yīng)的濃度變化一樣 ， 遵循一定的規(guī)律 。 圖 41是大腸桿菌在不同溫度下的殘留曲線 ， 可以看出溫度越高 ， k值 （ 斜率的絕對(duì)值 ） 越大 ，微生物越容易死亡 。 在相同的溫度下 ， k值越小 ， 則此微生物越耐熱 。 第一節(jié) 滅菌 表 42 121℃ 下幾種芽孢細(xì)菌的 k值 細(xì)菌名稱 k值 / min1 細(xì)菌名稱 k值 / min1 枯草芽孢桿菌 ～ 硬脂嗜熱芽孢桿菌FS617 硬脂嗜熱芽孢桿菌 FS1518 產(chǎn)氣梭狀芽孢桿菌PA3679 第一節(jié) 滅菌 隨著時(shí)間的延長 ， 加熱后的殘留菌數(shù)呈對(duì)數(shù)減少 ， 且溫度越高 ， 死亡越快 。 表 43是不同滅菌條件下培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的破壞情況 。 另一個(gè)問題是滅菌的程度 ， 如果要達(dá)到徹底滅菌 ， 即 Nt =0， 則 t要為 ∞ ， 實(shí)際操作中這顯然不可能 。 在工業(yè)上 ， 培養(yǎng)基的分批滅菌不需要專門的滅菌設(shè)備 ， 設(shè)備投資少 ， 滅菌效果可靠 ， 對(duì)滅菌用蒸汽要求低 （ ～ ） ， 但因其滅菌溫度低 、 時(shí)間長而對(duì)培養(yǎng)基成分破壞大 ， 其操作難于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)控制 。圖 43是通用式發(fā)酵罐常見的管路配備 。 進(jìn)料完畢后 ， 開動(dòng)攪拌以防料液沉淀 。 保溫結(jié)束后 ， 關(guān)閉過濾器排氣閥 、 排汽閥 、 進(jìn)汽閥 。 第一節(jié) 滅菌 （ 2） 分批滅菌的計(jì)算 分批滅菌的過程包括升溫 、保溫和降溫三個(gè)階段 ， 如圖 44所示 。 培養(yǎng)基的保溫階段 ， 是滅菌的主要時(shí)段 。 同時(shí) ，發(fā)酵罐的設(shè)備利用率也有所降低 。 求滅菌失敗機(jī)率為 。 1202 . 3 0 3 2 . 3 0 3 8 1 0l g l g 2 0 . 3 41 . 8 0 . 0 0 1tNt kN ?? ? ?第一節(jié) 滅菌 在升溫階段 ， 培養(yǎng)基溫度不斷升高 ， 菌死亡速率常數(shù)也不斷增大 ， 反應(yīng)速率常數(shù)與溫度有一定關(guān)系 。 km為這一溫度段內(nèi)的滅菌常數(shù)之平均值 (49) 式 （ 49） 中的積分可以通過圖解積分法求得 。 所以發(fā)酵罐體積越大 ， 其分批滅菌的升溫時(shí)間長 ， 就更應(yīng)該考慮升溫段的滅菌作用 ， 其保溫時(shí)間應(yīng)該更短 。 連續(xù)滅菌時(shí) ， 培養(yǎng)基在短時(shí)間內(nèi)被加熱到滅菌溫度 （ 一般高于分批滅菌溫度 ，130～ 160℃ ） ， 短時(shí)間保溫 （ 一般為 5～ 8min） 后 ， 被快速冷卻 ， 再進(jìn)入早已滅菌完畢的發(fā)酵罐 。 培養(yǎng)基的連續(xù)滅菌具有對(duì)培養(yǎng)基破壞小 、 可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)控制 、 提高發(fā)酵罐的設(shè)備利用率 、 蒸汽用量平穩(wěn)等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用 ， 尤其在培養(yǎng)基體積較大時(shí) 。 然后將培養(yǎng)基用泵打入預(yù)熱桶中 。 預(yù)熱好的培養(yǎng)基由連消泵打入加熱器 。 第一節(jié) 滅菌 加熱后通過保溫將培養(yǎng)基維持滅菌溫度一段時(shí)間 ， 這是殺滅微生物的主要過程 。 保溫結(jié)束以后 ， 必須迅速降溫至接近培養(yǎng)溫度 （ 40～45℃ ） ， 避免培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的破壞 。 如果采用維持罐保溫的還必須考慮返混的情況 ， 為確保滅菌效果 ， 實(shí)際維持時(shí)間常取理論滅菌時(shí)間的 3～ 5倍 。 第一節(jié) 滅菌 低質(zhì)量分?jǐn)?shù) (1％ ～ 2％ )的 NaCl溶液對(duì)微生物有保護(hù)作用 ， 隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加 ， 保護(hù)作用減弱 ， 當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá) 8％ ～ 10％ 以上則減弱微生物的耐熱性 。 第一節(jié) 滅菌 表 44 pH值對(duì)滅菌時(shí)間的影響 溫度/℃ 孢子數(shù)/（個(gè)/ml） 滅菌時(shí)間 /min pH值 pH值 pH值 pH值 pH值 120 10000 8 7 5 3 3 115 10000 25 25 12 13 13 110 10000 70 65 35 30 24 100 10000 740 720 180 150 150 第一節(jié) 滅菌 （ 3） 培養(yǎng)基中的顆粒 培養(yǎng)基中的顆粒小 ， 滅菌容易 ， 顆粒大 ， 滅菌難 。 對(duì)有泡沫的培養(yǎng)基進(jìn)行連續(xù)滅菌時(shí)更應(yīng)注意 。 對(duì)于容積小的發(fā)酵罐 ， 連續(xù)滅菌的優(yōu)點(diǎn)不明顯 ， 而采用分批滅菌比較方便 。 第一節(jié) 滅菌 （ 3） 空氣總過濾器和分過濾器滅菌 排出過濾器中的空氣 ， 從過濾器上部通人蒸汽 ， 并從上 、 下排氣口排氣 ，維持壓力 2h。 第一節(jié) 滅菌 第 （ 5）發(fā)酵培養(yǎng)基實(shí)罐實(shí)菌 從夾層或盤管進(jìn)入蒸汽，間接加熱至 90℃ ，關(guān)閉夾層蒸汽，從取樣管、進(jìn)風(fēng)管、放料管三路進(jìn)蒸汽，直接加熱至 121℃ ，維持 30min。 （ 8） 補(bǔ)料實(shí)罐滅菌根據(jù)料液不同而異 。 而空氣中除了含有氧氣外 ， 還含有其他多種成分 ， 其中有一些是不能進(jìn)入培養(yǎng)系統(tǒng)的 ， 因此必須對(duì)空氣進(jìn)行凈化 。 第二節(jié) 空氣凈化 第 空氣中微生物的數(shù)量和環(huán)境有著密切的關(guān)系。發(fā)酵用無菌空氣的設(shè)計(jì)和操作中常以通氣比或 VVM來計(jì)算空氣的用量。 ③進(jìn)入過濾器之前 ， 空氣的相對(duì)濕度 φ ≤ 70%。 ⑤ 壓縮空氣的潔凈度 ， 在設(shè)計(jì)空氣過濾器時(shí) ， 一般取失敗概率為103為指標(biāo) 。一般我們把這個(gè)流程中空氣過濾器以前的部分稱為空氣預(yù)處理階段。 第二節(jié) 空氣凈化 （ 2） 粗過濾器 粗過濾器安裝在空壓機(jī)吸入口前 ， 又稱前置過濾器 。 （ 3） 空氣壓縮機(jī) 空氣壓縮機(jī)的作用是提供動(dòng)力 ， 以克服隨后的各個(gè)設(shè)備的阻力 。 第二節(jié) 空氣凈化 第 （ 4） 空氣貯罐 空氣貯罐的作用是消除空氣壓縮機(jī)的脈動(dòng)，這對(duì)于往復(fù)式空壓機(jī)特別重要。 空氣冷卻器可采用列管式換熱器 ， 空氣走殼程 ， 管內(nèi)走冷卻水 。 第二節(jié) 空氣凈化 第 （ 6） 氣液分離設(shè)備 冷卻后的壓縮空氣，會(huì)有來自空壓機(jī)的潤滑油，尤其是往復(fù)式空壓機(jī)。 第二節(jié) 空氣凈化 第 （ 7） 空氣加熱設(shè)備 壓縮空氣經(jīng)過氣液分離設(shè)備把夾帶在空氣中的液滴、霧沫除去后，其相對(duì)濕度仍為 100%（如果冷卻到露點(diǎn)以下）?？諝鈨艋姆椒ㄓ袩釡缇?、 靜電除菌 、 介質(zhì)過濾除菌法 。纖維素、硅酸硼纖維、聚四氟乙烯等都可作為過濾介質(zhì)。 第二節(jié) 空氣凈化 第二節(jié) 空氣凈化 深層介質(zhì)過濾所用介質(zhì)的孔隙一般大于微生物細(xì)胞 ，為了達(dá)到所需的除菌效果 ， 介質(zhì)必須有一定的厚度 。第二類是將過濾材料做成纖維濾紙、金屬燒結(jié)板等，圖 48是超細(xì)玻璃纖維紙過濾器，這些材料除菌效率高，無需填充得很厚，如果用超細(xì)纖維玻璃紙只需要少量幾張就可以了。 總過濾器約每月滅菌一次 ，為了使總過濾器不間斷地進(jìn)行工作 ， 一般應(yīng)有備用 ， 以便在滅菌時(shí)替換使用 。因此過濾除菌的流程必須有供氣設(shè)備 —— 空氣壓縮機(jī)，對(duì)空氣提供足夠能量，同時(shí)還要具有高效的過濾除菌設(shè)備以除去空氣中的微生物顆粒。 第二節(jié) 空氣凈化 要保持過濾器在比較高的效率下進(jìn)行過濾 ， 并維持一定的氣流速度和不受油 、 水的干擾 ， 則要有一系列的加熱 、 冷卻及分離和除雜設(shè)備來保證 。 它是一個(gè)比較完善的空氣除菌流程 ， 可適應(yīng)各種氣候條件 。 經(jīng)第一冷卻器冷卻后 ，大部分的水 、 油都已結(jié)成較大的霧粒 ， 且霧粒濃度較大 ， 故適宜用旋風(fēng)分離器分離 。 第二節(jié) 空氣凈化 第 兩級(jí)冷卻、加熱除菌流程尤其適用于潮濕的地區(qū)，其他地區(qū)可根據(jù)當(dāng)?shù)氐那闆r，對(duì)流程中的設(shè)備作適當(dāng)?shù)脑鰷p。該流程適用于中等濕含量地區(qū)，但不適合于空氣濕含量高的地區(qū)。 此流程的特點(diǎn)是采用了高效率的前置過濾設(shè)備 ， 使空氣經(jīng)多次過濾 ， 因而所得的空氣無菌程度很高 。 第二節(jié) 空氣凈化 三、無菌檢測(cè)及發(fā)酵廢氣廢物的安全處理 1． 無菌檢測(cè) 工業(yè)生產(chǎn)中 ， 為明確責(zé)任 、 跟蹤生產(chǎn)進(jìn)程 、 及早發(fā)現(xiàn)染菌等問題 ， 一般在菌種制備 、 發(fā)酵罐接種前后和培養(yǎng)過程種都按時(shí)采樣 、 盡情無菌檢測(cè) 。 雙蝶法是取樣在雙蝶培養(yǎng)基上劃線 ， 取樣培養(yǎng) 6 h后反復(fù)劃線 ， 培養(yǎng) 24h后觀察有無菌落 。 空氣系統(tǒng)的無菌檢測(cè)主要考察過濾器是否失效 。大型發(fā)酵罐的排氣處理一般接到車間外經(jīng)沉積液體后從 “ 煙囪 ” 排出。那么，現(xiàn)在草率離婚是一錯(cuò)再錯(cuò)。飲鴆止渴的策略一時(shí)取