【正文】 都應(yīng)該在分開的區(qū)域進(jìn)行 。實(shí)驗(yàn)方案 1. PCR 2. Topo 復(fù)制 3. 變形轉(zhuǎn)化 4. Minipre DNA 5. 酶切 6. DNA 膠化回收和純化 (參照 Qiagen 記錄 ) 7. 連接酶 8. 陽性克隆對(duì)照 8. GST 融合蛋白質(zhì)準(zhǔn)備 I. Protocol for PCR with Taq DNA Polymerase II. TOPO174。 建議使用裝備有紫外線燈的 Laminar 流程內(nèi)閣裝置來混合反應(yīng)試劑 . 應(yīng)該為脫氧核糖核酸洗凈和每個(gè)反應(yīng)設(shè)定佩帶新鮮的手套 . 進(jìn)行 DNA 樣品和反應(yīng)混合準(zhǔn)備時(shí) , 我們強(qiáng)烈推 薦使用熱衷的船加樣槍及氣溶膠濾膜。有關(guān) PCR 實(shí)驗(yàn)室裝備和儀器維護(hù)的詳細(xì)指令在 PCR 方法和應(yīng)用軟件 3,2,S1S14,1993 中可以查找得到 . 一 .反應(yīng)混合體系的準(zhǔn)備 建立多個(gè)平行反應(yīng)體系 ,在單一反應(yīng)混合管中加入水 ,dNTPs ，引物和 Taq DNA 聚合酶 , 然后 分別 進(jìn)入 各 管中 進(jìn)行 消化，接著添加適量 MgCl2 和模板 DNA 。 如果熱量 cycler 裝備一個(gè)激昂的盒蓋，這 一步 可 以省略。 雖然用于脫氧核糖 核酸 洗凈規(guī)程的甚而痕量代理 (酚、乙二胺四乙酸、蛋白酶 K等等 )強(qiáng)烈禁止 Taq 脫氧核糖核酸聚合酶、脫 氧核糖核酸的對(duì)氨基苯甲酸二降雨雪和脫氧核糖核酸藥丸的反復(fù)治療與 70%對(duì)氨基苯甲酸二通常是有效的 在去除污染物蹤影從脫氧核糖核酸樣品。除此之外 , MgCl2 的濃度選擇主要是根據(jù)經(jīng)驗(yàn)而定 , 以 1mM 為起始體積每 mM 逐步增加 , 直到獲得一定產(chǎn)量的 PCR 產(chǎn)物。 然而，如果反應(yīng)混合物中混有抑制劑 (舉例來說 , 如果反應(yīng)使用的模板 DNA純化程度不 夠高 ），比較高含量的 Taq DNA 聚合酶 (23 u) 可能獲得更高的擴(kuò)增產(chǎn)物率。 起始變性階段 DNA 模板的完全變性 是 PCR 反應(yīng)的關(guān)鍵。 若 GC含量大于 50%，則變性時(shí)間要延長到 10MIN。 C 時(shí)酶的活性會(huì)迅速降低 . 變性階段 由于第一擴(kuò)增周期得到的 PCR產(chǎn)物通常都比模板 DNA 短，因此通常在 9495 176。加入這些試劑以后，引物 — 模板DNA的溶解溫度會(huì)發(fā)生比較大的變化，因此采用的退火溫度要根據(jù)實(shí)驗(yàn)本身具體確定。 C 并孵育 min 就足夠了。 C，在這個(gè)溫度下 Taq DNA Polymerase 具有較高的酶促活性，有利于 DNA 的復(fù)制。 后續(xù)延伸階段 在最後一個(gè)周期之後，樣品通常置于 72 176。 II. TOPO174。 Cloning，我們建議您按照手冊(cè)中所提供的詳細(xì)方案記錄進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 使用下列試劑建立以下 TOPO174。 Vector 1 μ l 總體積 6 μ l 緩慢混合，室溫下孵育 5 分鐘。 E. coli .加入 2 μ l Shot174。 C 熱休克 30 秒，然后立刻將試管轉(zhuǎn)移到冰上 . 室溫下加入 250 μ l . Medium. 37 176。 Buffer P1 （你也可以根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)需要設(shè)計(jì)）： 50 mM TrisHCl pH 10 mM EDTA 10 μ g/ml RNaseA ordered 和 RNaseA 也可以按 Qiagen 設(shè)定。 下列各項(xiàng)有從手冊(cè)被再生而且注解基於對(duì)有經(jīng)驗(yàn)者的裝備。 實(shí)驗(yàn)步驟 250 μ l buffer P1 中 (4 176。不旋渦 ,否則將會(huì)造成 genomic DNA 分子受剪切力作用機(jī)會(huì)增多。 避免局限性沉淀 , 小心而充分混勻，立即加入 Buffer N3, 立即產(chǎn)生渾濁。 旋轉(zhuǎn)離心 60 秒以獲得比較好的擴(kuò)增產(chǎn)物。 雖然說這個(gè)步驟僅供選擇，但是實(shí)際上它并不影響到產(chǎn)品的擴(kuò)增，當(dāng)使用 XL－ 1和 DH alpha 作宿主菌時(shí)， 你可以省去這些洗滌步驟 ....你可以認(rèn)為你正在操作 endA菌株，而實(shí)際他們是 endA＋菌株。 棄上清，繼續(xù)離心 1 min 除去 buffer。往每一支 QIAprep spin column 中加入 50 μ l Buffer EB (10 mM , pH )或滅菌蒸餾水洗脫 DNA，靜置 1min， 離心 1min。舉個(gè)例子來說 , 如果你在 Buffer EB 中洗脫樣品， 并且要用洗脫所得樣品進(jìn)行限制性酶切 ,那麼混雜在樣品中的鹽將影響酶切所得的鹽量。這一步操作 可以參考 sequencing center。 microfuge 中 PE洗滌后，干燥。反應(yīng)過程中鹽的污染有二 個(gè)主要來源 : 反應(yīng)管邊沿沾附的及使用 PE 洗脫過程中殘余的 PB。雖然這樣一來增加了一個(gè)步驟，但是花費(fèi)在這一步上的時(shí)間會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)比你在等待了三天之后卻發(fā)現(xiàn)你擴(kuò)增出來的系列不能使用要好得多了！ V. DNA 連接酶 任何人都應(yīng)該自主地把自己當(dāng)作是這個(gè) protocol 的負(fù)責(zé)人 .你不必因?yàn)槟闶秦?fù)責(zé)人你才用心去做。末 端核甘和 5’磷酸之間磷酸二酯鍵的形成。 T4 DNA 連接酶被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)中 DNA分子的連接以及粘性末端、平末端的連接。 如果用 于插入 DNA的質(zhì)粒鏈的比率過高，超過 39。插入物 ~宿主菌的摩 爾比例從 1:1 到 10:1 變化調(diào)適。 由于 buffer 含有 ATP， 因此反復(fù)冰凍、解凍溶解將降低 ATP活性從而影響連接酶的催化作用。 C 孵育 30 min . ligase 65 176。反應(yīng)條件是：質(zhì)粒載體 50 ng，按插入 DNA片段與質(zhì)粒 2:1的摩爾比例，加入標(biāo)準(zhǔn) T4 ligase， 置 16 176。產(chǎn)生的白色沉淀物是依照 NEB 設(shè)定的 BSA。 如果你所使用的 ligation 有問題 ,可以向 NEB FAQ39。使用熱鈍化的 ligase，能夠消除這個(gè)抑制作用，然 而， 依照 NEB FAQ，熱鈍化的 PEG（存在于酶聯(lián)反應(yīng)中的）也能抑制該變形轉(zhuǎn)換作用 ,因此如果你在實(shí)驗(yàn)過程中存在上述問題時(shí)，建議您在進(jìn)行轉(zhuǎn)換之前先進(jìn)行 spincolumn 純化。 4C 離心至細(xì)胞碎片沉于離心管底部 ,取上清 , 70176。. MATERIALS PBST: PBS (PhosphateBuffered Saline) + % Tween20 Resuspension Buffer: PBST + 2mM EDTA + % bME Thrombin Cleavage Buffer: Any buffer between pH with Ca++ is adequate. Try 50mM TRIS pH + 150mM NaCl + CaCl2 + % bME 50% Glutathione Agarose Beads (GST Beads) beads per 50ml: Rehydrate beads in large volume of water for at least an hour. Wash with several volumes PBST through Whatman filter on a Buchner funnel to remove maltose stabilizer. Collect gel and add equal volume of PBST. Store at 4C. Do not freeze beads are fragile and ice crystals will destroy. Ampicillin: , filter , store at 20C in 1ml aliquots. Use 1:1000. IPTG: stock solution: , store at 20C in 1ml aliquots Alternate 5x solution: 5g/42ml PMSF: stock solution in DMSO。 C處理 30 min ,然后加入凝膠 這不是樣品加載之前運(yùn)行的 .蛋白質(zhì)凝膠電泳要比核酸凝膠慢 ,因此可能需要更長的電泳時(shí)間 .電泳的條件是 :20CM 凝膠，電泳 3~4小時(shí) ,當(dāng)然電泳所需的時(shí)間取決于樣品性質(zhì) .電泳的功率約為 23 watts,電泳約 30 minutes ,之后功率 增加到 810 做法是 ,使用 markers 對(duì)泳動(dòng)樣品 進(jìn)行標(biāo)記 ,這樣可以達(dá)到兩個(gè)目的 : (1)監(jiān)控電泳過程 ,指示任何運(yùn)行凝膠 .(2)提供分子量標(biāo)記 ,以便于讓你標(biāo)記所需要的電泳時(shí)間 . 固定干燥 蛋白質(zhì)凝膠電泳類似于核酸凝膠電泳，但蛋白質(zhì)凝膠要注意濃縮層的輻射作用，并注意將輻射層銷毀處理．如果凝膠層中含有被 32P標(biāo)記的樣品ＤＮＡ，你也可以將其干燥處理后直接用于核酸凝膠電泳．如果凝膠中含有 35S 蛋氨酸樣品必須固定凝膠，洗凈，擴(kuò)增（使用 Amersham 進(jìn)行擴(kuò)增可以大大縮短暴光時(shí)間）放射自顯影，固定凝膠，洗脫 20 min： 50% methanol， 10% acetic acid, 40% water，將凝膠浸泡水中，洗凈，擴(kuò)增裝置中洗滌 20 min，純水中漂洗．如果沒有過多的游離 methione 擴(kuò)散到溶液中，擴(kuò)增裝置可以重復(fù)使用３～４次甚至更多次．這些游離的 methione 會(huì)使電泳的結(jié)果偏大．將凝膠轉(zhuǎn)移到 saran wrap，經(jīng) Whatman 濾紙?zhí)幚?，真空干燥，這樣凝膠中被 32P 標(biāo)記的樣品將暴露出來．除去含有 35S 樣品的凝膠中的 saran wrap．注意在凝膠表面覆蓋一薄片，這樣一來，凝膠層就不會(huì)粘在顯影膠片上了．我運(yùn)用他并使用 kimwipe 是可行的．非放射性 凝膠染色會(huì)造成 coomassie blue，銀的污染．這一方法是全新的，但通常我們不運(yùn)行這一類型的凝膠，因此在這里我就不作詳細(xì)介紹了，如果有誰認(rèn)為自己不需要染色非放射性凝膠．，我會(huì)非常樂意提供一些參考意見． 試劑 RECIPES: 1. Stacking Gel Buffer 125 mM TrisHCl。 pH % SDS ml To make a 4X Stock (500ml) g Tris base。 pH 2% SDS 10% Glycerol 1% bMercaptoethanol mM EDTA % Bromophenol Blue To make a 4X Stock (10 ml) ml 1M TrisHCl。 189。 C 透析瞬間煮沸的透析管溶液：冰凍的 20mMTrisHCl,10mM 氯化鈉、 EDTA. 透析液 2升透析 3X. 260nm 和 280nm 處測定 DNA. 一個(gè)典型 的產(chǎn)量從