重組dna技術(shù)與重組蛋白表達(dá)-wenkub
2023-05-21 22:23:37 本頁面
【正文】 轉(zhuǎn)化質(zhì)粒在酵母細(xì)胞中的命運(yùn) 酵母菌的轉(zhuǎn)化程序 用于轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因 酵母的轉(zhuǎn)化程序 酵母原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法 早期酵母菌的轉(zhuǎn)化都采用在等滲緩沖液中穩(wěn)定的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法 在 Ca2+和 PEG的存在下 ， 轉(zhuǎn)化細(xì)胞可達(dá)原生質(zhì)體總數(shù)的 12%。 酵母菌自主復(fù)制型質(zhì)粒的構(gòu)建組成包括復(fù)制子 、 標(biāo) 記基因、提供克隆位點(diǎn)的大腸桿菌質(zhì)粒 DNA。 C 酵母的載體系統(tǒng) 6 外源基因在酵母中的表達(dá) 酵母克隆表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 酵母中的野生型質(zhì)粒 酵母中的野生型質(zhì)粒 釀酒酵母中的 2m環(huán)狀質(zhì)粒 幾乎所有的釀酒酵母中都含有 2m雙鏈 同源重組 REP1 RAF STB ori REP2 FLP IR IR A B 環(huán)狀質(zhì)粒，拷貝數(shù)達(dá) 50至 100個(gè)。 酵母菌普遍擁有蛋白 質(zhì)的糖基化系統(tǒng)，但野生 型釀酒酵母對(duì)異源蛋白的 糖基化反應(yīng)很難控制，呈 超糖基化傾向，因此超糖 基化缺陷株非常重要。 如果說大腸 桿菌是外源基因最成熟的原核生物表達(dá)系統(tǒng) ， 則酵母菌是最成熟的真 核生物表達(dá)系統(tǒng)。 酵母的分類學(xué)特征 真核生物 ， 分屬于 子囊菌綱 （ 子囊酵母 ） 、 擔(dān)子菌綱 （ 擔(dān)子酵母 ） 、 A 酵母作為表達(dá)外源基因受體的特征 6 外源基因在酵母中的表達(dá) 酵母表達(dá)外源基因的優(yōu)勢 全基因組測序，基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理比較清楚，遺傳操作簡便 能將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中 具有原核細(xì)菌無法比擬的真核蛋白翻譯后加工系統(tǒng) 大規(guī)模發(fā)酵歷史悠久、技術(shù)成熟、工藝簡單、成本低廉 不含有特異性的病毒、不產(chǎn)內(nèi)毒素，美國 FDA認(rèn)定為安全的 基因工程受體系統(tǒng)（ Generally Recognized As Safe GRAS） 酵母菌是最簡單的真核模式生物 B 酵母的宿主系統(tǒng) 6 外源基因在酵母中的表達(dá) 提高重組蛋白表達(dá)產(chǎn)率的突變宿主 抑制超糖基化作用的突變宿主 減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主 廣泛用于外源基因表達(dá)的酵母宿主 廣泛用于外源基因表達(dá)的酵母宿主 目前已廣泛用于外源基因表達(dá)和研究的酵母包括： 酵母屬 如 釀酒酵母 （ Saccharomyces cerevisiae） 克魯維酵母屬 如乳酸克魯維酵母（ Kluyveromyces lactis） 畢赤酵母屬 如 巴斯德畢赤酵母 （ Pichia pastoris） 裂殖酵母屬 如非洲酒裂殖酵母（ Schizosaccharomyces pombe） 漢遜酵母屬 如多態(tài)漢遜酵母（ Hansenula polymorpha） 其中釀酒酵母的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究最為詳盡，但巴斯德畢赤酵母 表達(dá)外源基因最理想。 甘露糖生物合成缺陷型 天門冬酰胺側(cè)鏈糖基化缺陷型 外側(cè)糖鏈添加缺陷型 減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主 泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解作用 蛋白酶體 Lys HOOC Ubiquitin 76 aa ubiquitin ligase E3 Lys ubiquitin ligase E3 Lys 靶蛋白 靶蛋白 靶蛋白 減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主 酵母菌泛素依賴型蛋白降解系統(tǒng)的編碼基因 酵母菌共有四個(gè)泛素編碼基因： UBI 1 編碼泛素 羧基延伸蛋白 52（ CEP52） 對(duì)數(shù)生長期表達(dá) 穩(wěn)定期關(guān)閉 UBI 2 編碼泛素 羧基延伸蛋白 52（ CEP52） 對(duì)數(shù)生長期表達(dá) 穩(wěn)定期關(guān)閉 UBI 3 編碼泛素 羧基延伸蛋白 76（ CEP76） 對(duì)數(shù)生長期表達(dá) 穩(wěn)定期關(guān)閉 UBI 4 編碼泛素五聚體 對(duì)數(shù)生長期關(guān)閉 穩(wěn)定期表達(dá) 酵母菌共有七個(gè)泛素連接酶基因： UBC UBC UBC UBC UBC UBC UBC 7 減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主 泛素降解途徑衰減的釀酒酵母 在釀酒酵母菌中，泛素主要由 UBI 4基因表達(dá)， UBI 4突變株能 UBI 4缺陷型： 正常生長，但細(xì)胞內(nèi)游離泛素分子的濃度比野生株要低得多， 因此 UBI 4缺陷突變株是外源基因表達(dá)理想的受體。 IRs 反向重復(fù)序列， 600 bp， 重組 FLP 編碼產(chǎn)物驅(qū)動(dòng) IRs的同源重組 REP 編碼產(chǎn)物控制質(zhì)粒的穩(wěn)定性 STB REP的結(jié)合位點(diǎn) 接合酵母屬中的 pSR1和 pSB1， 以及 克魯維酵母屬中的 pKD1等均與 2m質(zhì) 粒類似。 以 ARS為復(fù)制子的質(zhì)粒稱為 YRp 上述兩類質(zhì)粒在釀酒酵母中的拷貝數(shù)最高可達(dá) 200個(gè) ， 但培養(yǎng)幾代 以 2m質(zhì)粒上的復(fù)制元件為復(fù)制子的質(zhì)粒稱為 YEp 后，質(zhì)粒的丟失率高達(dá) 50%70%，主要是由于分配不均勻所致。 但該程 序操作周期長，而且轉(zhuǎn)化效率受到原生質(zhì)再生率的嚴(yán)重制約。 用于轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因 用于酵母菌轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因主要有 營養(yǎng)缺陷型 互補(bǔ)基因和 顯性基因 兩大類： 營養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如： LEU、 TRP、 HIS、 LYS、 URA、 ADE 但對(duì)于多倍體酵母來說，篩選營養(yǎng)缺陷型的受體非常困難。 酵母表達(dá)系統(tǒng)的選擇 釀酒酵母的基因表達(dá)系統(tǒng)最為成熟，包括轉(zhuǎn)錄活性較高的甘油 醛 3磷酸脫氫酶基因 GAPDH、 磷酸甘油激酶基因 PKG、 乙醇脫氫 釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng) 酶基因 ADH所屬的啟動(dòng)子，多種重組外源蛋白獲得成功表達(dá)。 乳酸克魯維酵母表達(dá)分泌型和非分泌型的重組蛋白 ， 性能均優(yōu) 于釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)。 在此情況下 ， 外源基因的 有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的重組蛋白在巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)中獲得成功表達(dá)。 所不同的是 ， HARS質(zhì)粒 能高頻 自發(fā)地整合在受體的染色體 DNA上 ， 甚至可以連續(xù)整合 100多個(gè)
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