【正文】 染色步驟 ： 取 1 106/ml細(xì)胞 ， 洗去固定劑 ， 加入 2ml AO 工作液 ， 在室溫 (23℃ )下染 30分鐘上機(jī)分析。采取酸變性可達(dá)到這種目的 ， 一般采用EDTA處理 ， 使 RNA解鏈 ， AO染色過程中 ， 也可使沒有解鏈的 RNA繼續(xù)解鏈 ， 由于 A0分子量大 ， 在活細(xì)胞AO染色時 ， 不易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi) ， 可用去污劑在細(xì)胞膜上打孔 ， 使 AO進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。 這種方式的結(jié)合 ， 主要以 AO與 DNA的結(jié)合。 6. 丫啶橙 (AO)DNA/RNA熒光染色 ： AO是一種用于定量細(xì)胞優(yōu)良的熒光探針 ， AO染色細(xì)胞后 ， 在熒光顯微鏡下 ， 可見清晰的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu) ， DNA呈黃綠色熒光 ， RNA呈桔紅色熒光。與 DNA堿 基對 AT特異性結(jié)合 ， 許多研究者認(rèn)為 ， DAPI這個熒光染料比其他熒光染料所測組方圖的變異系數(shù)都小 ， 尤其在石蠟 包 埋組織 DNA檢測中 ， 所測組方圖的質(zhì)量好于其他染料染色的 DNA組方圖。 1989年Dean等采用雙激光流式細(xì)胞儀 ， 激發(fā)波長為紫外光351/364nm和藍(lán)色激發(fā)光為 458nm， 分析了人的淋巴母樣細(xì)胞株 GMB的核型 。所以用于研究 DNA異質(zhì)性定量分析不適宜。krishan等 ,H033342活染研究了一株抗阿霉素的白血病細(xì)胞 ， 分析發(fā)現(xiàn)染色效果極差 ， 可能由于活細(xì)胞的鈣離子泵通道開放 ， 將染料泵出細(xì)胞外 ， 因此 ， 在染活細(xì)胞時 ， 使用一些影響鈣泵的試劑。 3. DNA染色赫斯特類熒光染料 ： 赫斯特 (Hoechst HO)類是抗原蟲的藥物性熒光染料。 同時在標(biāo)記細(xì)胞 DNA 成分 時 , 不與 RNA 結(jié)合 , 因此在對 DNA特異性定量染色時 , 不需要用 RNase 處理細(xì)胞 。 首先用 50μg/ml的 PI染色僅染死細(xì)胞 ， 而活細(xì)胞不著色 ， 后用 5μg/ml PI去污劑染色液 ， 可以在活細(xì)胞膜上打孔 ， 將 PI引入細(xì)胞內(nèi) ， 但不損傷細(xì)胞活性 ， FCM分析后 ， 收集細(xì)胞可作繼續(xù)培養(yǎng)。 B. 50ug/ml PI 染液 : 以 PBS配制 染色步驟 ： 取培養(yǎng)單細(xì)胞樣品 1 106/ml， 洗去培養(yǎng)液 ， 先加入 50μg/ml PI染液 ， 先使死細(xì)胞染色10分鐘后 ， PBS離心洗滌棄之 ， 再加入 5μg/ml PI去污劑染液 ， 染 20分鐘即可上機(jī)分析。 ⑶ EB、 PI染細(xì)胞 DNA鑒別死活細(xì)胞 EB、 PI是染 DNA特異性熒光探針 ， 由于其不透過活細(xì)胞完整細(xì)胞膜 ， 只能進(jìn)入細(xì)胞膜有損傷的細(xì)胞。 ② EB兩步染色 ： 染液配制 A液 ： EB10mg， 生理鹽水 650ml，枸緣 酸 鈉 ， Rnase l0mg，NP40 (或 Tritonx100 %)加水至 1000ml， 調(diào)。 這兩種染料都不能通過活細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與核酸結(jié)合 ， 因此 ，可以用于鑒別死活細(xì)胞 。 1. 溴 化乙 啶 (EB )和 碘 化丙 啶 (PI)熒光染色 : EB和 PI這兩種熒光染料的理化特性類似 ， 同屬于插入性熒光染料 ， 可選擇性的定量嵌入核酸 (DNA RNA)雙螺旋的 堿 基之間 ， 其熒光發(fā)射均為橙紅色 ， 如果都使用 氬 離子激光 488nm激發(fā) ， EB發(fā)射出的熒光波長在 603610nm， PI發(fā)射光譜波長在 610620nm范圍 。文獻(xiàn)中已報道了雞紅細(xì)胞用戊二 醛 固定 48小時后 ， 經(jīng)488nm的激發(fā)光激發(fā)而產(chǎn)生較強(qiáng)的自發(fā)熒光 ( 詳見“ FCM 標(biāo)準(zhǔn)樣品及其作用 ” 一章 ) 。 研究發(fā)現(xiàn)中性白細(xì)胞有較高的自發(fā)熒光 ， 嗜酸性白細(xì)胞的自發(fā)熒光光譜中核黃素相似 。 可提供細(xì)胞形態(tài)多種信息供參考 。 作為計算各群細(xì)胞體積的實際大小 。已有作者采用前向散射即小角散射 (176。 ⑶ 熒光顯微鏡下觀察 ， 熒光的分布是否具有一個核形態(tài)結(jié)構(gòu) ， 熒光分布是否均勻一致 ， 并可看到一些熒光顆粒。 ⑵ 插入性或稱嵌入性結(jié)合方式 ， 熒光染料分子直接嵌入到核酸堿基對之間 ， 這種方式結(jié)合緊密 、 穩(wěn)固 ,不易造成熒光染料分子的丟失 ， 如 溴 化乙 啶 (EB)、 碘 化丙 啶(PI)、 7 氨基放線菌素 D(7AAD)等 。FCM 定量細(xì)胞參量和熒光探針 河北省腫瘤研究所 左連富 一 、 細(xì)胞參量 能夠被 FCM 定量分析的細(xì)胞參量很多 ,人們把這些可供檢測的細(xì)胞參量分為內(nèi)部和外部參量 ,同時又將內(nèi)部與外部參量分為功能性和結(jié)構(gòu)性參量 。 ⑶ 結(jié)構(gòu)親合方式 ， 以靜電力結(jié)合 ， 帶有正電荷的熒光分子與帶有負(fù)電荷的核酸中的磷酸相互吸引而結(jié)合 ， 這種方式結(jié)合極弱 ， 常造成熒光分子的丟失 ， 例如 ：丫啶 橙與核酸單鏈結(jié)合時 ,派若寧與單鏈核酸結(jié)合系以靜電力方式。 ⑷ 流式定量分析評價 ， ( 以 DNA 為例 )， 在 DNA 組方圖上 ， G0/l峰與 G2M峰是否成倍數(shù)關(guān)系 。 )與側(cè)向散射 (90176。 根據(jù) FCM 定量細(xì)胞大小 ， 也可對死活細(xì)胞進(jìn)行鑒別 。 2. 細(xì)胞自發(fā)熒光參量 FCM 檢測 : 大部分哺乳類動物細(xì)胞內(nèi)的 吡啶 或黃素類 核苷酸都存在自發(fā)熒光 ， 可用紫外光激發(fā)出藍(lán)色熒光或用藍(lán)光激發(fā)出綠色熒光 。 在 1987年日本學(xué)者就利用 FCM 對胃粘膜細(xì)胞自發(fā)熒光進(jìn)行了探索 ， 發(fā)現(xiàn)早期胃癌細(xì)胞的自發(fā)熒光比正常胃細(xì)胞自發(fā)熒光強(qiáng) ， 由此 用于 早期胃癌 的診斷 。 四 、 細(xì)胞的外部結(jié)構(gòu)參量 FCM 檢測 測量細(xì)胞外部結(jié)構(gòu)參量必須用熒光染色 ， 在熒光標(biāo)記后才能通過 FCM 的檢測 ， 以獲得細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)和功能的信息 ， 下面重點介紹一些細(xì)胞外部參量和常用的熒光探針 。PI發(fā)射波長較 EB長 10nm， 所以 PI、 EB這兩種染料可以相互替代 。 在染色活細(xì)胞時 ， 要采用膜打孔方法 ， 把染料引入細(xì)胞內(nèi) ， 或?qū)⒓?xì)胞固定 ， 另外 ，這兩種染料可與雙鏈的 RNA也產(chǎn)生結(jié)合 ， 所以在染色細(xì)胞 DNA時 ， 要用 RNA酶處理細(xì)胞 ， 以排除 RNA對定量 DNA含量精度的干擾 。 B液 ： 枸緣 酸 鈉 15mg， 蔗糖 90g， ， 蒸 餾 水 1000ml。因此對死細(xì)胞可以標(biāo)記，而活細(xì)胞不著色，近年來將EB、 PI染色用于細(xì)胞凋亡 ( Apoptosis )或程序性細(xì)胞死亡 (Program cell death PCD)的研究中。分析后收集細(xì)胞仍可繼續(xù)培養(yǎng)。 (MI)、 色霉素 A3(CA3) 和橄欖霉素 : 光神霉素是一個抗腫瘤的抗生素?zé)晒馊玖?。 Crissman等對這三種染料的熒光染色進(jìn)行了詳細(xì)的研究 , 他們發(fā)現(xiàn) , 對酒精和戊二 醛 固定的細(xì)胞 DNA最優(yōu)化的染色濃度在 50100ug/ml， pH在 , NaCl 的濃度在 , 鎂 離子 1520mM(MI、 CA3 和橄欖霉素與 DNA結(jié)合需要 鎂 離子形成復(fù)合物 )。與 DNA特異性結(jié)合 ,包括有 H03325 H03332H033378 H033662。 H033342活染細(xì)胞常用濃度 515μg,(或終濃度 25μg/ml將染液直接加入培養(yǎng)基中。 H033258常與 CA3結(jié)合用于流式核型的分析。 Van Dilla 等還采用 H033258和CA3對 DNA不同 堿 基對的結(jié)合 ， 鑒別不同的細(xì)菌種類 ，這將對于臨床治療是十分有用的。 DAPI染液配制 ， 先以 蒸餾 水配制成， 放冰箱暗處保存 ， 染色時用 PBS液稀釋為 50μg/ml,在室溫下染 1520分鐘即可上機(jī)分析。 AO常用于標(biāo)記細(xì)胞 DNA/RNA的雙參數(shù) FCM定量分析 ， AO與核酸的結(jié)合有兩種方式 ： ① 強(qiáng)結(jié)合方式 ， 又稱插入性結(jié)合方式 ， A0分子插入在雙鏈核酸的 堿 基之間 ， 每有一個 A0分子與 DNA鏈結(jié)合 ， 雙鏈結(jié)構(gòu)就發(fā)生 26度的構(gòu)型旋轉(zhuǎn)變化。 ② 弱結(jié)合方式 ， 即靜電吸引結(jié)合方式 ， 帶正電荷的 A0分子與帶負(fù)電荷的磷酸根結(jié)合 ， 每個磷酸根的位點上均可結(jié)合一個 A0分子 ， 最大結(jié)合率為 1:1， 結(jié)合在0位上的 A0分子親合力最強(qiáng) ， 這種結(jié)合方式主要是 A0分子與單鏈的 RNA結(jié)合。用 % Tritonx100短時間處理細(xì)胞即可。 Ⅱ 、 AO染色活細(xì)胞的程序 ： 先 配制 A液和 B液 ， A液 ： Tritonx100 %， HCl ， NaCl 。調(diào) pH (注 : 不含 AO的 B液可在冰箱保存數(shù)月 ， 但加入 AO后 ， 必須在 24小時內(nèi)使用 ， 不能保存日期過長 ) 染色步驟 : ① 取 1 106/ml的培養(yǎng)細(xì)胞。 TOT和 YOY是花青 苷 類的兩個新的熒光染料。 TOT或 YOY用于 FCM DNA熒光標(biāo)記 ， 其激發(fā)光波長為 488nm和 457nm， 熒光發(fā)射波長為 530nm和 510nm，單獨用于染色體流式核型分析 ， 可用紫外線和 488nm激發(fā)光 。取細(xì)胞懸液 1 106/ml， 洗去 70%酒精固定劑。在細(xì)胞周期中 ,對正常二倍體細(xì)胞的 G0， G1期細(xì)胞的分析研究單獨定量 DNA是無法將其區(qū)別 ， 細(xì)胞生物學(xué)研究早已證實 ，在 G1期細(xì)胞不進(jìn)行 RNA合成 ， 只有在 G0期進(jìn)行 RNA合成 ， 因此通過 RNA定量分析 ， 便可區(qū)別 G0， G1期細(xì)胞 ， 并可揭示細(xì)胞增殖功能狀態(tài)。 PY熒光染色方法 : ①配制 PY母液 ， PY 100ml蒸餾 水 ， 置 4℃ 冰箱保存。 ③ DNA酶消化液配制 :DNA酶 ， 酸， , 20mol/L TrisHCL調(diào) Ph為 ④取 1 106/ml細(xì)胞，加入 ， 37℃ 消化20分鐘，棄去 DNA酶液，加入 % PY工作液 ，室溫下染色 30分鐘， PBS洗去染液 ， 再加入 上機(jī)檢測。還有人認(rèn)為 ， DNA和 RNA的聚合程度不同 ，DNA聚合程度高 ， 甲基綠著色 ， RNA聚合度低與派若寧 Y結(jié)合。取甲基 綠 + 蒸餾 水 l00ml， 甲基綠配制后 ， 以純氯仿提純 ，由于甲基綠中混有甲基紫成分 ， 在染色時 ， 需將甲基紫洗去。然后加入 ， 室溫下染 30分鐘 ， PBS離心洗一次 ， 加入 PBS 分析。染色過程簡單 ，不污染管道 ， 但需要雙激發(fā)光源 ， 儀器操作復(fù)雜。 雖然這些熒光探針?biāo)鶛z測的網(wǎng)織紅細(xì)胞計數(shù)與手工光鏡下計數(shù)有較好的相關(guān)性 ， 但均存在不足之處 ，PY DIOCl(3)和 AO與 RNA結(jié)合缺乏嚴(yán)格的量效關(guān)系。 TO染色具體方法 ： ① 用甲醇液配制 lmg/ml TO儲備液 。 細(xì)胞總蛋白質(zhì)含量的流式檢測 ， 其常用的熒光探針多為酸性熒光染料 ， 蛋白質(zhì)的熒光染色受著酸性熒光染料離子化狀態(tài)和染色溶液pH值的影響