激光共聚焦顯微鏡原理和操作-wenkub
2023-05-21 02:29:26 本頁面
【正文】 ： 70mV 線粒體膜電位： 150mV 以上均屬于陽離子探針，更容易與線粒體親和，為線粒體膜電位探針 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 七 ． 熒光能量共振轉(zhuǎn)移 ( fluorescence Resonance Energy Transfer) 能量轉(zhuǎn)移：能量從分子的一個(gè)部位向另一個(gè)部位的傳遞 ，或能量從一個(gè)分子向另一個(gè)分子傳遞 。 將外源基因與 GFP DNA 相連 , GFP可作為外源基因的報(bào)告基因?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)外源基因的表達(dá) . 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 GFP主要應(yīng)用 : ? 對(duì)活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確定位及動(dòng)態(tài)觀察 可實(shí)時(shí)原位跟蹤特定蛋白在細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂、分化過程中或外界刺激因子的作用下的時(shí)空表達(dá) , 如某種轉(zhuǎn)錄因子的 核轉(zhuǎn)位 、蛋白激酶 C的 膜轉(zhuǎn)位 等。 HeNe: 633nm Ar激光器 (UV): 361nm ? 激光器的特點(diǎn) : 1) 方向性好 : 激光基本延直線傳播 2) 單色性好 :??=108nm 3) 高亮度 : 激光方向性好 , 其在空間上的能量分布是高度 集中的 。 照明針孔 與 探測(cè)針孔 對(duì) 被照射點(diǎn) 或 被探測(cè)點(diǎn) 來說是 共軛 的 ， 因此被探測(cè)點(diǎn)即共焦點(diǎn) ， 被探測(cè)點(diǎn)所在的平面即共焦平面 。 計(jì)算機(jī)以像點(diǎn)的方式將被探測(cè)點(diǎn)顯示在計(jì)算機(jī)屏幕上 ， 為了產(chǎn)生一幅完整的圖像 ， 由光路中的掃描系統(tǒng)在樣品焦平面上掃描 ， 從而產(chǎn)生一幅完整的 共焦圖像 。 4) 偏振性 : 激光為平面偏振光 , 光纖耦合 激光掃描共焦顯微鏡技術(shù) 5. 四個(gè)熒光通道 , 一個(gè)透射光通道 即除了可同時(shí)采集多標(biāo)記熒光圖像外 還可以同時(shí)采集透射光圖像 ,但透射光 圖像為 非共焦圖像 。 ? GFP基因與分泌蛋白基因連接后轉(zhuǎn)染細(xì)胞 , 可動(dòng)態(tài)觀察 該分泌蛋白分泌到細(xì)胞外的過程 ? GFP基因與定位于某一細(xì)胞器特殊蛋白基因相連 ,就能顯 示活細(xì)胞中細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線粒體等細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)及病理過程 ? 可用于觀察分子的運(yùn)動(dòng)（ FRAP） ? 蛋白之間的相互作用（ FRET） 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 三 .動(dòng)態(tài)測(cè)量 ? Physiology:細(xì)胞內(nèi)離子動(dòng)態(tài)變化測(cè)量 1).游離 Ca2+測(cè)量 檢測(cè)游離 Ca2+變化熒光探針的原理：這類探針多為 Ca2+螯合劑，不與Ca2+結(jié)合時(shí)不發(fā)熒光，通常也不能進(jìn)入細(xì)胞膜，只有與乙酰甲酯 AM相連方可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，被細(xì)胞內(nèi)酯酶水解后并與胞內(nèi)游離鈣結(jié)合后發(fā)出熒光。 能量的提供者叫能量供體 ， 能量的接受者叫能量受體 。細(xì)胞內(nèi)生理Ca2+濃度值 (10100n M)，細(xì)胞內(nèi) Ca2+超載濃度值（基礎(chǔ) Ca2+濃度的 10倍左右） 熒光探針 激發(fā)波長(zhǎng) 發(fā)射波長(zhǎng) Kd FLuo3AM, K+, dextran 506nm 525nm 390nM Fluo4 506nm 525nm Calcium Green1 507nm 530nm 190nM Calcium Green2 507nm 535nm 550nM Fura red 420/480nm 637nm 140nM Oregon Green 488 494nm 520nm 20,000nM Calcium Crimson 583nm 602nm 328nM Indo1 356nm 405/458nm 230nM Fura2 340/380 476nm 145nM 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 ?程序化測(cè)量：用 timelapse中的編程按鈕可進(jìn)行不同時(shí)間序列的掃描測(cè) 量 。 然而水母整體幾提取的顆粒都呈綠色 ， 后經(jīng)證實(shí)在水母體內(nèi)還存在另外一種發(fā)光蛋白即 綠色熒光蛋白 GFP, 后經(jīng)研究表明 ， 在水母體內(nèi) Ca2+和腸腔素與水母發(fā)光蛋白結(jié)合后 ，水母發(fā)光蛋白產(chǎn)生藍(lán)色熒光 ， GFP在藍(lán)光的激發(fā)下 ， 產(chǎn)生綠色熒光 。 激光掃描共焦顯微鏡技
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