基因診斷培訓(xùn)講義(已修改)
2025-01-15 18:07 本頁面
【正文】 第 16章 基因診斷 王慧蓮 概述 ? 幾乎所有的疾病均在一定程度上與基因有某種聯(lián)系，基因的改變，或是疾病發(fā)生的原因，或是疾病發(fā)生的結(jié)果，或是疾病發(fā)生時(shí)的伴隨現(xiàn)象，而這些現(xiàn)象的出現(xiàn)是有規(guī)律的。因此，可以通過檢測基因的改變來反映疾病的發(fā)生和發(fā)展，療效和預(yù)后 ? 基因診斷：是以 DNA或 RNA為診斷材料，通過檢查基因的存在、缺陷或表達(dá)異常，對(duì)人體狀態(tài)和疾病作出診斷的方法和過程。 基因診斷經(jīng)歷了三個(gè)基本發(fā)展階段 ? 第一階段：２０世紀(jì)８０年代，以 DNA分子雜交為基礎(chǔ)，通過限制性片段長度多態(tài)性性（ RFLP)分析進(jìn)行． ? 第二階段：應(yīng)用 PCR技術(shù)． ? 第三階段：應(yīng)用基因芯片技術(shù)． 第一節(jié) 基因診斷的基礎(chǔ)技術(shù) 一 .基因診斷中常用的幾種技術(shù) （一） 核酸雜交 （二） PCR （ 三） DNA序列測定 （四） DNA芯片技術(shù) (一 )核酸分子雜交技術(shù) (1)方法 : 以已知順序核酸片段作為探針 ,經(jīng)放射性或非放射性物質(zhì)標(biāo)記后 ,再與未知的目的核酸片段進(jìn)行雜交反應(yīng) ,分離已雜交和未雜交的標(biāo)記核酸鏈 ,通過標(biāo)記信號(hào)的檢測就可以對(duì)未知的目的核酸鏈進(jìn)行定性、定量分析 . (2)幾種不同形式的核酸分子雜交 a. Southern印跡 (southern blot)雜交 : 用于 DNA的檢測，可用于基因的限制性內(nèi)切酶譜分析，基因突變分析等． b. Northern印跡 (Northern blot)雜交 : 用于 RNA的檢測，能對(duì)組織細(xì)胞中的總 RNA 或 mRNA進(jìn)行定性和定量分析． c. 斑點(diǎn)雜交（ dot blot): 既可以檢測 DNA也可以檢測 RNA,用于特定基因及其表達(dá)的定性和定量分析．方法簡單、靈敏；但特異性低． d. 原位雜交（ in situ hybridization): e. f. 是細(xì)胞學(xué)技術(shù)與核酸雜交技術(shù)結(jié)合的一種核酸分析檢測技術(shù)．可分為 DNA原位雜交和 RNA原位雜交 ,用于檢測染色體中特定的基因位置，用于染色體疾病的診斷． g. 分類 : ① 玻片原位雜交 :如中期的染色體和組 h. 織切片 . i. ② 膜上原位雜交 :將菌落或噬菌斑影印在尼 j. 龍膜 (如硝酸纖維膜 ) k. 原位雜交的鏡像圖 (二 )PCR技術(shù)在基因診斷中的應(yīng)用 （１）等位基因特異性寡聚核苷酸（ allele specific oligonnucleotide,ASO)探針斑點(diǎn)雜交： PCRASO 該方法是 診斷已知點(diǎn)的突變： 需分別合成野生型和突變型探針．在基因診斷時(shí)，只需用 PCR擴(kuò)增受檢者目的 DNA片段，再分別與上述探針雜交．雜交的結(jié)果有如下幾種情況： ① PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與正常探針雜交，不與突變探針雜交 不 存在這種突變； ② 只與突變探針雜交 突變基因?yàn)榧兒献樱? ③ 與正常探針和突變探針都可雜交 突變基因?yàn)殡s合子； ④ 與正常探針和突變探針都不能雜交 突變基因不屬于已發(fā) 現(xiàn)的類型 （２）單鏈構(gòu)象多態(tài)性（ single strand conformation ploymorphism,SSCP)分析 是一種基于單鏈 DNA構(gòu)象差別來檢測點(diǎn)突變的方 法． DNA變性形成單鏈，在中性條件下長度相同的單 鏈指 DNA,如果堿基組成和 (或 )排列順序不同 ,形成的 構(gòu)象就不同 ,這樣就形成了單鏈構(gòu)象多態(tài)性 .這些分子在非變性 PAGE中電泳中表現(xiàn)出不同的遷移率 . SSCP特別適于分析小于 400bp 的 PCR產(chǎn)物。據(jù)認(rèn)為 SSCP可以區(qū)分 1bp的差異 PCRSSCP分析不能確定基因變異的內(nèi)容，因此電泳后結(jié)果有差異后還需進(jìn)行測序分析，確定變異性質(zhì) (3)限制性片段長度多態(tài)性（ restriction fragment length polymorphisms,RFLP） 分析 ? 基因突變導(dǎo)致的基因堿基組成或 (和 )順序發(fā)生改變 ,會(huì)在基因結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生新的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)或使原有的位點(diǎn)消失 . 用限制酶對(duì)不同個(gè)體基因組進(jìn)行消化時(shí)，其電泳條帶的數(shù)目和大小就會(huì)產(chǎn)生改變，根據(jù)這些改變可以判斷出突變是否存在 . 限制性片段長度多態(tài)性 RFLPs ( restriction fragment length polymorphisms) 樣品一 樣品二 1987年 , RFLP為遺傳標(biāo)記繪制了第一張人類遺傳圖譜 (4)PCR+變性梯度凝膠電泳分析技術(shù) 雙鏈 DNA在一定濃度變性劑 (尿素 ,甲酰胺 )作用下 ,會(huì)變性而解鏈 ,導(dǎo)致 DNA分子電泳遷移率變化 .當(dāng)在不同梯度濃度變性膠中電泳時(shí) , DNA泳動(dòng)到變性劑濃度能使 DNA發(fā)生變性， DNA開始解鏈，從而不同的 DNA片段會(huì)形成不同的遷移率條帶． 優(yōu)點(diǎn) ：可靠，檢出單堿基突變率可達(dá)９５％． 缺點(diǎn) ：富含高熔點(diǎn) GC區(qū)時(shí)，則難以檢測出突 變
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