【正文】 Chapter 15 Rebinant DNA and Geic Engineering 基因工程的概念 一、 基因工程 的概念： 利用 DNA體外重組或 PCR擴(kuò)增技術(shù)從某種生物基因組中 分離感興趣的基因 ， 或是用人工合成的方法獲取基因 ， 然 后經(jīng)過(guò)一系列切割 ， 加工修飾 ， 連接反應(yīng)形成重組 DNA分 子 ， 再將其轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞 ， 以期獲得基因表達(dá)的過(guò) 程 . 基因工程 (gene engineering)常和以下名稱混用 ? 遺傳工程 (geic engineering)。 ? 基因克隆 (gene cloning)。 ? 分子克隆 (molecular cloning)。 ? 基因操作 (gene manipulation)。 ? 重組 DNA技術(shù) (rebination DNA technique) ? 克隆 (clone): 作名詞時(shí)指含有某目的 DNA片段的重組DNA分子或含有該重組分子的無(wú)性繁殖系 . 基因工程的概念 二、基因工程的主要內(nèi)容或（步驟） 從復(fù)雜的生物有機(jī)體基因組中，經(jīng)過(guò)酶切消化或 PCR擴(kuò)增等步驟，分離出帶有目的基因的 DNA片段。 在體外，將帶有目的基因的外源 DNA片段連接到能夠自我復(fù)制的并具有選擇記號(hào)的載體分子上，形成重組 DNA分子。 將重組 DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞 (亦稱寄主細(xì)胞 )，并與之一起增殖。 從大量的細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組 DNA分子的受體細(xì)胞克隆。 從這些篩選出來(lái)的受體細(xì)胞克隆，提取出已經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因，供進(jìn)一步分析研究使用。 將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入寄主細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì)。 基因工程的概念 三、 基因工程的應(yīng)用 ? 醫(yī)藥 ： 生物制藥；基因治療；人工器官 ? 農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè) 轉(zhuǎn)基因植物 ：抗病蟲(chóng)害新品種、抗逆新品種、 高品 質(zhì)新品種 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 ：生產(chǎn)有用蛋白質(zhì)和高品質(zhì)的畜產(chǎn)品 生物反應(yīng)器 ：利用動(dòng)植物細(xì)胞或組織作為生物反應(yīng)器， 直接生產(chǎn)有用蛋白質(zhì) ? 輕工與食品 新型食品；營(yíng)養(yǎng)食品；保健食品；輕工用酶 ? 環(huán)境 污染治理；廢物利用；污染物生物降解 基因工程的概念 供體細(xì)胞目的基因載體重組D N A 分子轉(zhuǎn)化細(xì)胞受體細(xì)胞多肽藥物疫苗、抗體基因治療基因診斷 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物( 畜牧業(yè)、漁業(yè) 生物反應(yīng)器)轉(zhuǎn)基因植物( 農(nóng)業(yè)、林業(yè) 生物反應(yīng)器)冶金、環(huán)保輕工、 基因工程的概念 轉(zhuǎn)基因植物 基因工程的概念 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物作為生物發(fā)生器 基因工程的概念 基因工程中的工具酶 ? 限制性內(nèi)切酶 — 主要用于 DNA分子的特異切割 ? DNA甲基化酶 — 用于 DNA分子的甲基化 ? 核酸酶 — 用于 DNA和 RNA的非特異性切割 ? 核酸聚合酶 — 用于 DNA和 RNA的合成 ? 核酸連接酶 — 用于 DNA和 RNA的連接 ? 核酸末端修飾酶 — 用于 DNA和 RNA的末端修飾 ? 其它酶類 — 用于生物細(xì)胞的破壁 ， 轉(zhuǎn)化 ， 核酸純化 ，檢測(cè)等 基因工程中的工具酶 一、限制性內(nèi)切酶 （ 一 ） 、限制修飾系統(tǒng)的種類 （二）、限制性內(nèi)切酶的定義、命名 （三）、限制酶的特點(diǎn) （四）、異源同序酶（ isoschizomer，同裂酶） （五）、限制酶的用途 基因工程中的工具酶 一種限制酶 只 能 識(shí)別一種 特定核苷酸序列 ；并在 特定 切點(diǎn) 切割． 限制性核酸內(nèi)切酶 —— “分子手術(shù)刀” 來(lái)源： 種類： 作用： 主要是微生物 4000種。 基因工程中的工具酶 （一）、限制修飾系統(tǒng)的種類 1. Ⅰ 型 ：由三個(gè)基因構(gòu)成， hsdR； hsdM； hsdS（ host specificity for DNA restriction modification and specificity）位于染色體上，三個(gè)基因構(gòu)成一個(gè)復(fù)合體，限制酶需要 ATP、 Mg2+、SAM（５ — 腺苷甲硫氨酸），無(wú)特異切割位點(diǎn)。 2. Ⅱ 型 ：限制與修飾基因產(chǎn)物獨(dú)立起作用，在 Ｅ . coli中這兩種基因位于質(zhì)粒上。 3. Ⅲ 型 ：修飾酶與Ｉ型酶相同， hsdＭ與 hsdＳ基因產(chǎn)物結(jié)合成一亞單位，限制酶是獨(dú)立存在的。 上述三個(gè)系統(tǒng)中，只有 II型限制酶與甲基化酶具有相當(dāng)高的核苷酸識(shí)別特異性，因而被廣泛用于基因工程中。 基因工程中的工具酶 （二）、限制性內(nèi)切酶的定義、命名 1. 定義 ：廣義指上述三個(gè)系統(tǒng)中的限制酶； 狹義指 Ⅱ 型限制酶。 2. 命名 ：限制酶由三部分構(gòu)成，即菌種名、菌系編號(hào)、分離順序。 例如： HindⅢ 前三個(gè)字母來(lái)自于菌種名稱 H. influenzae，“ ｄ ”表示菌系為ｄ型血清型；“ Ⅲ ”表示分離到的第三個(gè)限制酶。 EcoRI— Escherichia coli RI 基因工程中的工具酶 （三）、限制酶的特點(diǎn) 1. 識(shí)別順序和酶切位點(diǎn) １）識(shí)別４ 8個(gè)相連的核苷酸 MboI NGATCN； AvaII GG(A/T)CC BamHI GGATCC： PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC； SfiI GGCC N N N N N GGCC CCGGN’ N’ N’ N’ N’ CCGG ２ ） 富含ＧＣ ３）對(duì)稱性 — 雙對(duì)稱 EcoRI 5’ G A A T T C3’ 3’ C T T A A G5’ ４）切點(diǎn)大多數(shù)在識(shí)別順序之內(nèi)，也有例外 ５）限制酶切后產(chǎn)生兩個(gè)末端，末端結(jié)構(gòu)是５’ Ｐ和３’ ＯＨ 基因工程中的工具酶 2. 末端種類 １）３’ 端突起，個(gè)數(shù)為２或４個(gè)核苷酸 Pst I 5’ CTGCAG3’ 5’ CTGCA G3’ 3’ GACGTC5’ 3’ G ACGTC5’ ２）５’ 端突起，個(gè)數(shù)為２或４個(gè)核苷酸 EcoRI 5’ GAATTC3’ 5’ GOH PAATTC3’ 3’ CTTAAG5’ 3’ CTTAAP HOG5’ 粘性末端能與另一個(gè)相同的粘連末端相連接，任何兩個(gè)具有相同識(shí)別 位點(diǎn)的 DNA分子經(jīng)限制酶切割后能夠重新連接成新的重組 DNA分子。在進(jìn)行 DNA重組時(shí)，應(yīng)用限制酶同時(shí)切割目的基因和載體 DNA，使之產(chǎn)生相對(duì)的粘 性末端，然后再將二者連接成重組 DNA分子