【正文】 齊 齊 哈 爾 大 學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）題 目 粒表達(dá)載體構(gòu)建 齊齊哈爾大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì)(論文)摘 要癌癥嚴(yán)重威脅著人類的健康，其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)?；熥鳛槠涑Ｒ?guī)臨床治療手段，在癌癥治療中具有手術(shù)和放射治療不能替代的作用。腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性（multidrug resistance, MDR）是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞化療失敗的主要原因。腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥的原因較為復(fù)雜，多藥耐藥相關(guān)蛋白1（Multidrug Resistanceassociated Protein 1，MRP1）的過(guò)度表達(dá)是導(dǎo)致其產(chǎn)生多藥耐藥的主要原因之一。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的能快速、高效、特異的沉默目的基因表達(dá)的技術(shù)，如能通過(guò)RNAi技術(shù)沉默MDR1基因，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性將為改善癌癥病人的化療效果奠定基礎(chǔ)。目的：。構(gòu)建針對(duì)mrp1 mRNA的RNA干擾表達(dá)載體。方法：，構(gòu)建靶向mrp1 siRNA重組質(zhì)粒。 DH5α后大量提取重組質(zhì)粒，經(jīng)菌落 PCR和 DNA測(cè)序分析檢測(cè)重組載體構(gòu)建結(jié)果。結(jié)果：。為下一步抑制mrp1基因在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)奠定基礎(chǔ)。 關(guān)鍵詞：RNA干擾；MRP1；；穿梭載體 AbstractCancer, a serious threat to human health, the incidence are on the rising trend. Chemotherapy as the routine clinical therapy of tumor, which is an irreplaceable way in cancer treatment. MDR of tumor cell cause the failure of chemotherapy treatment . The reason causing the cancer MDR is relatively plicated, and the excessively expression of multidrug resistanceassociated protein 1(MRP1) is one of the reasons causing MDR. Silencing MDR1 gene by RNAi, we can improve the effect of chemotherapy by decrease the level of MDR.Objective: In this study, Methods: According to mrp1 we designed and synthesized the DNA fragment that was cloned into Results: Constructing Key Words：RNA interference；MRP1；；shuttle vector目 錄摘 要 IAbstract II第1章 緒 論 1 RNAi的研究進(jìn)展 1 RNAi的發(fā)現(xiàn)過(guò)程 1 RNAi的分子作用機(jī)制 2 RNAi的特點(diǎn) 3 siRNA簡(jiǎn)介 3 siRNA的設(shè)計(jì)原則 3 RNAi在抗腫瘤方面的研究 4 用于RNAi的載體 4 5 質(zhì)粒人工構(gòu)建的目的 5 MRP1的研究進(jìn)展 5 MRP的轉(zhuǎn)運(yùn)底物、組織分布及生理作用 6 MRP在組織中的表達(dá) 6 基因治療 7 本課題在國(guó)內(nèi)外的研究現(xiàn)狀 7 本論文的研究目的及意義 8 本論文的主要內(nèi)容 8第2章 實(shí)驗(yàn)材料與方法 9 實(shí)驗(yàn)材料 9 宿主菌 9 質(zhì)粒載體 9 載體通用引物 11 主要試劑及工具酶 11 主要儀器 12 實(shí)驗(yàn)方法 13 shRNA的設(shè)計(jì)與退火 13 合成干涉片段的退火 16 重組載體的構(gòu)建 17 20 測(cè)序鑒定重組載體 21 重組質(zhì)粒大提的OD值檢測(cè) 21第3章 結(jié)果與分析 22 質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ和BamHI雙酶切后膠回收結(jié)果 22 質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ和BamHI雙酶切后結(jié)果 22 目的片段的回收 23 重組載體的菌落PCR 24 重組質(zhì)粒大量提取 25 重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果 26討 論 29 菌落PCR鑒定重組 29 重組質(zhì)粒穿梭載體的構(gòu)建 29結(jié) 論 30參考文獻(xiàn) 31致 謝 3431 齊齊哈爾大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì)(論文)第1章 緒 論 RNAi的研究進(jìn)展RNA干擾(RNA interference , RNAi)是由雙鏈RNA分子介導(dǎo)的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默過(guò)程，為一種雙鏈RNA分子在mRNA 水平上關(guān)閉相關(guān)基因表達(dá)的過(guò)程，是一項(xiàng)新興的基因阻斷技術(shù)。RNAi有望成為分析人類基因組功能的有力工具，在腫瘤病因、免疫機(jī)制及治療等方面的研究上有廣闊的發(fā)展前景。 RNAi的發(fā)現(xiàn)過(guò)程1990年，Rich Jorgensan 和他的同事在對(duì)矮牽?；ㄟM(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，無(wú)意中發(fā)現(xiàn)一種奇怪的現(xiàn)象。他們嘗試把pigmentproduing這種由強(qiáng)有力的啟動(dòng)子控制的基因?qū)氚珷颗；ㄒ约由罨ǖ淖仙?，結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)不但顏色未加深，許多花呈現(xiàn)雜色甚至白色。Rich Jorgensan 把這種現(xiàn)象稱為共同抑制，因?yàn)閷?dǎo)入了外源性基因，使得和內(nèi)源性基因具有相似功能的基因的表達(dá)都被抑制了[1]。遺憾的是當(dāng)時(shí)這種現(xiàn)象并未引起Jorgensen 的重視。1994年，Cogoni[2]和Macino采用粗糙脈胞霉進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)真菌中也存在類似的現(xiàn)象，他們稱之為基因抑制，這一現(xiàn)象后來(lái)在其它真菌中也相繼被發(fā)現(xiàn)。1995 年 Guo[3] 等在對(duì)線蟲(chóng)的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，正義 RNA 與反義 RNA 一樣可以阻斷par21 基因的表達(dá)，可惜作者同樣對(duì)這一現(xiàn)象也沒(méi)有更深入的研究，只做了普通的報(bào)道。直到 1998年，關(guān)于 RNAi 現(xiàn)象的研究才被人們真正的發(fā)現(xiàn)[4]。Fire[5]等將雙鏈 RNA，即正義鏈和反義鏈的混合物，注射到線蟲(chóng)的體內(nèi)，卻誘發(fā)了比正義鏈或反義鏈的單獨(dú)注射效果更強(qiáng)的基因沉默，要徹底使同源基因的表達(dá)沉默，在每一個(gè)細(xì)胞中，只需要很少的幾個(gè)分子的雙鏈就可以做到。在接下來(lái)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中還證實(shí)[6]，將雙鏈RNA注入線蟲(chóng)體內(nèi)后 ，不但阻斷了線蟲(chóng)體內(nèi)所有同源基因的表達(dá)，同時(shí)還沉默了其第 1 代子代的同源基因，他們從此把這種現(xiàn)象命名為 RNAi。隨后，RNAi 現(xiàn)象又陸續(xù)在果蠅、錐形蟲(chóng)、真菌、渦蟲(chóng)、植物及斑馬魚(yú)等真核生物的研究中被發(fā)現(xiàn)[7]。這種情況揭示了RNAi現(xiàn)象可能出現(xiàn)于生命進(jìn)化的早期階段，在RNAi機(jī)制發(fā)現(xiàn)之前，不同生物中的RNAi現(xiàn)象有著不同的描述：真菌中稱為“鎮(zhèn)壓”作用，在植物中被稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默和基因協(xié)同抑制 [8]。 RNAi的分子作用機(jī)制RNAi的作用機(jī)制在眾多學(xué)者的努力研究下日漸明朗。不同生物體內(nèi)的RNA干擾作用機(jī)制也各有不同，但是主要可以分為兩種類型：特異效應(yīng)作用機(jī)制與非特異效應(yīng)作用機(jī)制。特異性效應(yīng)一般發(fā)生在短雙鏈RNA（21～23nt）上，非特異性效應(yīng)發(fā)生于長(zhǎng)雙鏈RNA（30nt以上）。[9]。其中，RNAi的特異效應(yīng)作用機(jī)制是在多個(gè)不同的水平上實(shí)現(xiàn)的，包括翻譯水平、轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平等。其中，轉(zhuǎn)錄后水平RNA干擾的研究最為深入，應(yīng)用也最為廣泛。[10] 特異性效應(yīng)轉(zhuǎn)錄后水平的RNA干擾的發(fā)生機(jī)制是在對(duì)果蠅、線蟲(chóng)等生物體進(jìn)行科學(xué)研究從而進(jìn)一步推導(dǎo)得出來(lái)的。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和RNAi研究的深入，人們對(duì)RNAi的作用機(jī)制的了解也越來(lái)越多，通過(guò)生化和遺傳學(xué)研究，現(xiàn)在普遍認(rèn)為RNAi可能的作用機(jī)制主要包括兩個(gè)階段：第一步：起始階段，即內(nèi)源或外源dsRNA經(jīng)特定的RNase III 家族的雙鏈特異的核糖核酸酶(Dicer) 以ATP 依賴的方式將長(zhǎng)的dsRNA 切割成21～23 nt的小干擾RNA；第二步，效應(yīng)階段，即siRNA與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物RISC結(jié)合共同降解靶mRNA[11]。除此之外還有某些研究認(rèn)為RNAi的作用機(jī)制還存在著第三階段——循環(huán)放大階段。這是RNAi的自身循環(huán)放大機(jī)制，其機(jī)制主要是指在效應(yīng)階段，RISC活化后與mRNA結(jié)合，mRNA被內(nèi)切核酸酶切割成大小在l2～23nt不等的小片段，這些片段可以特異性地阻礙表達(dá)靶基因。同時(shí)，釋放出來(lái)一種可以作為特殊引物的siRNA，從而以靶mRNA為模板在RdRP的作用下，合成新的dsRNA。這種dsRNA可以降解成新的siRNA，在這個(gè)循環(huán)中表現(xiàn)出放大效應(yīng) [10]。抑制相應(yīng)mRNA的翻譯可阻礙相應(yīng)的蛋白質(zhì)表達(dá)，這就是翻譯水平的RNA干擾機(jī)制[12]，其中stRNA起到了非常的重要作用。轉(zhuǎn)錄水平上的RNA機(jī)制是通過(guò)siRNA與互補(bǔ)的DNA直接發(fā)生作用，從而加強(qiáng)同源DNA的甲基化，以阻礙目的基因轉(zhuǎn)錄，使表達(dá)關(guān)閉，從而強(qiáng)化基因沉默。有文獻(xiàn)談到組蛋白H3及相應(yīng)DNA區(qū)域可被dsRNA誘導(dǎo)甲基化。一旦啟動(dòng)子區(qū)域出現(xiàn)甲基化，那么轉(zhuǎn)錄將被阻斷，如編碼區(qū)出現(xiàn)甲基化，則可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，但在轉(zhuǎn)錄后水平上沉默。 非特異效應(yīng)研究表明，長(zhǎng)度大于30nt的長(zhǎng)雙鏈RNA轉(zhuǎn)染至哺乳動(dòng)物體內(nèi)，dsRNA會(huì)激活雙鏈RNA所依賴的蛋白激酶途徑[13]，從而導(dǎo)致EIF2α因子磷酸化，進(jìn)而非特異性地抑制翻譯，誘發(fā)全面的細(xì)胞基因沉默。 RNAi的特點(diǎn)RNAi具有高效性，也就是說(shuō)與細(xì)胞內(nèi)的mRNA的量相比，注入細(xì)胞內(nèi)的siRNA的量要少得多。但由于循環(huán)放大機(jī)制的存在，仍可以有效地阻斷目的基因的表達(dá)；同時(shí)，RNAi也具有高特異性，小干擾RNA由dsRNA降解得到的，除在序列識(shí)別中不起主要作用的正義鏈3′端的兩個(gè)堿基以外，其余堿基均為必需。任何單個(gè)堿基的改變即導(dǎo)致RNAi失效，RNAi能特異性降解mRNA，針對(duì)同源基因共有序列的RNAi則可使同源基因全部失活。除此之外，RNAi還具有共抑制性、種屬時(shí)效性和dsRNA的長(zhǎng)度限制性的特點(diǎn)。 siRNA簡(jiǎn)介RNA干擾作用是通過(guò)siRNA（small interfering RNA，siRNA）這類小RNA分子作為較穩(wěn)定的中間介質(zhì)實(shí)現(xiàn)的。通過(guò)對(duì)植物的研究證明，雙鏈RNA復(fù)合體降解為35nt左右的小RNA分子后通過(guò)序列互補(bǔ)與mRNA結(jié)合，進(jìn)而降解mRNA。RNaseIII核酶家族的Dicer是RNA干擾中一個(gè)非常重要的酶。它可以結(jié)合到dsRNA上，并剪切其成為21～23nt且339。端突出的小分子RNA片斷，形成siRNA。[14] siRNA的設(shè)計(jì)原則RNAi 作用的成功與否，關(guān)鍵在于siRNA序列的結(jié)構(gòu)，不同結(jié)構(gòu)的siRNA序列沉默基因的效率差別很大， 2001年，Elbashir S M等[15]應(yīng)用化學(xué)合成法合成了siRNA，并發(fā)現(xiàn)可以誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物發(fā)生RNAi，他們進(jìn)而據(jù)此提出了siRNA 設(shè)計(jì)方法：1) 從起始密碼下游50~100nt開(kāi)始搜索siRNA以避免出現(xiàn)于5′或3′端的UTRs 的蛋白結(jié)合位點(diǎn)，；2)搜索5′AA(N19)UU序列，如果沒(méi)有相應(yīng)序列，可以選擇5′AA(N21)或5′NA(N21)；3)G/C含量在32%~79%之間[16]； 4) 要確定siRNA對(duì)靶基因的特異性，可以利用Blast軟件在基因組中進(jìn)行比對(duì)，；5)設(shè)置在基因組中無(wú)對(duì)應(yīng)序列的siRNA的對(duì)照siRNA。但是，Elbashir S M等的設(shè)計(jì)方法siRNA 篩選效率仍然很低，要更好的掌握RNAi，提高效率，理性設(shè)計(jì)siRNA有效序列成為siRNA 研究的重要方向。目前, 影響siRNA功能的因素包括siRNA序列的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，靶mRNA的空間結(jié)構(gòu)RISC與siRNA的相互作用，以及siRNA與mRNA錯(cuò)配等[17]。 RNAi在抗腫瘤方面的研究目前對(duì)腫瘤的治療手段主要有藥物化學(xué)治療、手術(shù)切除和放射治療，這些治療方法均無(wú)法做到特異性地殺傷及完全根除腫瘤，而且副作用較大。RNAi 具有特異性、簡(jiǎn)易性及高效性的特點(diǎn)，可穩(wěn)定沉默突變基因，而對(duì)正?；虻谋磉_(dá)不產(chǎn)生影響，在腫瘤的研究及治療上有著無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)。隨著 RNAi 技術(shù)的不斷成熟，腫瘤的研究有了空前突破，研究的重點(diǎn)主要在有關(guān)腫瘤免疫逃逸、腫瘤性疾病信號(hào)傳導(dǎo)的途徑、癌基因及抑癌基因的敲除、提高腫瘤對(duì)化療及放療的敏感性等方面[18]。 用于RNAi的載體基因工程中，攜帶目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的工具，稱為載體。是指能夠運(yùn)載外源DNA片段（目的基因）進(jìn)入受體細(xì)胞，具有自我復(fù)制能力，使外源DNA片段在受體細(xì)胞中得到擴(kuò)增和表達(dá)，不被受體細(xì)胞的酶系統(tǒng)所破壞的一類DNA分子。載體具有以下的功能：（1）運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞；（2）為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力；（3）為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件。目前使用的已知載體除了大腸桿菌中的質(zhì)粒、λ噬菌體、M13噬菌體、噬菌粒外，還有酵母、細(xì)菌人工染色體載體以及動(dòng)、植物病毒載體等[19]作為基因工程中使用的載體必須具備以下條件：（1）有復(fù)制起點(diǎn)，在受體