【正文】 應(yīng)用固相pH梯度的雙向電泳(2D)原理與方法80642960Edition AB 雙向電泳原理與方法原 著Tom Berkelman Tirra StenstedtBengt BjellqvistNancy LairdMichael McDowellIngmar OlssonReiner Westermeier英文版序 (Agelika G246。rg)(略)中文譯本說明為了便于國(guó)內(nèi)雙向電泳用戶更加方便快捷地了解雙向電泳的原理和方法，我們將2D Electrophoresis using immobilized pH gradients: Principle and Methods一書翻譯成中文。每位IPGphor用戶都有此書的英文原版。原翻譯稿據(jù)Rev A/ 1098舊版本譯成，在此基礎(chǔ)上根據(jù)新的Edition AB版本重新校譯編排而成。有些以數(shù)據(jù)為主的表，為了不至傳抄錯(cuò)訛，直接拷貝自原文。 因翻譯水平所限，譯文如有表達(dá)不確或疏漏之處，請(qǐng)以原文為準(zhǔn)。安瑪西亞中國(guó)有限公司目 錄概述 1手冊(cè)的概述 1雙向(2D)電泳概述 1手冊(cè)中使用的標(biāo)記符號(hào) 2第一向等電聚焦（IEF）的儀器選擇 3第二向SDSPAGE電泳設(shè)備的選擇 4儀器的選擇 6等電聚焦系統(tǒng)的選擇 6第二向電泳的設(shè)備選擇 8MultiphorII平板型設(shè)備 8垂直系統(tǒng) 9實(shí)驗(yàn)室技術(shù) 9第一章 11樣品制備 11 樣品制備——一般策略 11 細(xì)胞破碎的方法 13 溫和的裂解方法 13 劇烈的裂解方法 15 防止蛋白質(zhì)水解 16 蛋白質(zhì)沉淀 18 除去影響雙向電泳結(jié)果的污染物 20 樣品溶液的組成 23第二章 25第一向等電聚焦(IEF) 25 第一向等電聚焦——概述 25 等電聚焦(IEF)的背景 25 29 30 IPG干膠條再水化溶液 31 31 34 MultiphorⅡ和Immobiline干膠條套件（Immobiline DryStrip Kit） 34 IPG干膠條再水化——Immobiline干膠條再泡脹盤（Immobiline DryStrip Reswelling Tray） 34（IEF） 36 樣品杯加樣 38 紙橋（paperbridge）上樣(圖 16) 40 等電聚焦的原則 40 方法舉例—Multiphor II 41 電泳 41 聚焦后的膠條保存 43 問題解決 43 Ettan IPGphor 等電聚焦設(shè)備 45 IPG干膠條再水化—Ettan IPGphor膠條槽 46 IPG干膠條再水化——用于Ettan IPGphor 杯上樣膠條槽 49 54 方法舉例—IPGhor 55 進(jìn)行電泳（Running a protocol） 56 問題解決 59第三章 61第二向 SDSPAGE 61 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳概述 61 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的背景 61 IPG膠條平衡 62 62 63 Ettan DALTtwelve系統(tǒng) 64 DALTtwelve分離單元 64 Ettan DALT預(yù)制膠 65 平衡IPG膠條 67 放置平衡的IPG膠條 67 將預(yù)制膠模具插入Ettan DALTtwelve分離單元中 68 69 準(zhǔn)備SDS凝膠——垂直系統(tǒng) 70 問題解決 73 MultiphorII平板電泳設(shè)備 74 ExcelGel的準(zhǔn)備 74 76 電泳條件 77 問題解決 77第4章 79染色及結(jié)果分析 79 對(duì)電泳的結(jié)果進(jìn)行染色 79 80 分析 81 82 蛋白點(diǎn)的后續(xù)分析 82 切點(diǎn) 82 蛋白的酶解 83 MALDIToF 質(zhì)譜 83第五章 84問題解決方法 84 雙向電泳的問題解決方法 84附錄 I 94溶液 94A．樣品裂解液 94B．不含有IPG緩沖液的再水化儲(chǔ)存液* 94C．含有IPG緩沖液的再水化儲(chǔ)存液* 95D．SDS平衡緩沖液* 95E．單體儲(chǔ)液 96F．4分離膠緩沖液 96G．10%SDS 96H．10%過硫酸銨 96I．凝膠儲(chǔ)存液 97J．SDS電泳緩沖液* 97K．瓊脂糖密封液 97附錄II 用PlusOne蛋白銀染試劑盒染Ettan DALT凝膠的優(yōu)化方法 98參考文獻(xiàn) 99其它讀物和參考材料 104推薦的其它耗材 104訂購(gòu)信息 105概述手冊(cè)的概述本手冊(cè)提供了進(jìn)行高分辨雙向電泳的方法。你可以根據(jù)樣品的種類和研究目的來調(diào)整和優(yōu)化雙向電泳的程序。本手冊(cè)共分四章。第一章提供樣品制備的方法。第二章講述雙向電泳第一向的詳細(xì)過程。第四部分介紹了利用IPG膠條進(jìn)行第二向電泳的一般方法。第五部分討論了雙向電泳凝膠染色和結(jié)果分析。這里講到的雙向方法使用Amersham Biosciences公司的產(chǎn)品，設(shè)備的選擇我們?cè)诒?中介紹。雙向(2D)電泳概述雙向電泳(Twodimensional electrophoresis)是分析從細(xì)胞、組織或其它生物樣品中提取出來的蛋白混合物最有力和廣泛應(yīng)用的方法。這項(xiàng)技術(shù)利用蛋白質(zhì)在兩次獨(dú)立的分離步驟中的特性將蛋白質(zhì)分開：第一向步驟——等電聚焦（IEF）根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pI）將蛋白質(zhì)分離。在第二向步驟中SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS—PAGE）利用蛋白質(zhì)的分子量（Mr, 相對(duì)分子量）大小將它們分離。雙向電泳所得結(jié)果的斑點(diǎn)序列都對(duì)應(yīng)著樣品中的單一蛋白。因此，上千種蛋白質(zhì)均能被分離開來，并且各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，分子量和含量的信息都能得到。39。Farrel (1) (2)發(fā)明，在早先的技術(shù)中，第一向分離在含有載體兩性電解質(zhì)窄試管中灌注而成的凝膠中進(jìn)行。，“IEF的背景”。自從雙向電泳技術(shù)產(chǎn)生以來，雙向電泳作為生化分離技術(shù)的重要性事實(shí)上早已被承認(rèn)。而由于各方面的改進(jìn)在最近幾年才廣泛應(yīng)用。固相pH梯度和Immobiline?試劑(3)的產(chǎn)生使第一向等電聚焦的分辨率和重復(fù)性上有很大提高?；谶@項(xiàng)新技術(shù)，(4,5)研究出現(xiàn)在正在使用的2D技術(shù)，固相pH梯度代替了載體兩性電解質(zhì)產(chǎn)生的pH梯度，帶支持膜凝膠代替了管膠。“IEF背景”中有更詳細(xì)的討論 新的質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展到能快速識(shí)別和鑒定取自單個(gè)2D凝膠斑點(diǎn)微量的蛋白質(zhì)和多肽。 現(xiàn)在可以購(gòu)得功能更強(qiáng)大而價(jià)格更低的計(jì)算機(jī)及軟件，從而使對(duì)雙向電泳復(fù)雜的圖像進(jìn)行分析的投入可被接受。 現(xiàn)在可以得到一些生物體的整個(gè)基因組數(shù)據(jù)，從而可以迅速地識(shí)別編碼雙向電泳分離的蛋白的基因。 點(diǎn)圖像數(shù)據(jù)庫(kù)和基因組序列數(shù)據(jù)庫(kù)直接可以簡(jiǎn)單直接地通過萬維網(wǎng)訪問，分別可用來比較雙向電泳結(jié)果和序列信息。雙向電泳技術(shù)正在增長(zhǎng)的一個(gè)大的應(yīng)用領(lǐng)域是“蛋白質(zhì)組分析”。蛋白質(zhì)組分析是“分析一個(gè)基因組表達(dá)的整個(gè)蛋白質(zhì)集合”。分析包括對(duì)來自一個(gè)樣品的大量蛋白質(zhì)同時(shí)進(jìn)行系統(tǒng)地分離、識(shí)別和定量。雙向電泳由于能同時(shí)分離上千種蛋白而得到應(yīng)用。在鑒定轉(zhuǎn)錄后和共轉(zhuǎn)錄修飾的能力方面雙向電泳也是獨(dú)一無二的，這些修飾不能通過基因組序列預(yù)測(cè)。雙向電泳的應(yīng)用包括蛋白質(zhì)組分析、細(xì)胞差異性分析、疾病標(biāo)志檢測(cè)、治療檢測(cè)、藥物開發(fā)、癌癥研究、純度檢測(cè)和微量蛋白純化。本手冊(cè)對(duì)使用從Amersham Biosciences公司購(gòu)得的預(yù)制IPG干膠條(Immobiline DryStrip gels)手冊(cè)中使用的標(biāo)記符號(hào)224。 此符號(hào)對(duì)應(yīng)原文中的，表明是對(duì)于一般性的改進(jìn)建議或在特殊情況下推薦采取的措施★ 此符號(hào)對(duì)應(yīng)原文的，表明是應(yīng)該嚴(yán)格遵守的建議或需要特別注意的警告◆ 此符號(hào)對(duì)應(yīng)原文的，表明是解決問題建議。表 1. 雙向電泳的儀器選擇第一向等電聚焦（IEF）的儀器選擇MultiphorTMII 電泳儀和Immobiline 干膠條套件在再泡脹盤中進(jìn)行再水化使用Immobiline干膠條套件在Multiphor II電泳儀進(jìn)行等電聚焦選擇因素：? Multiphor II 電泳儀既可以進(jìn)行第一向也可以進(jìn)行第二向分離。? MultiphorII 電泳儀是多功能系統(tǒng)，對(duì)利用724cm IPG膠條進(jìn)行等電聚焦沒有限制。其它的電泳也可以在這臺(tái)儀器上進(jìn)行。圖1. Multiphor II 電泳儀和Immobiline 干膠條套件注意：此儀器需要EPS3501XL電源和MultiTemp?III恒溫循環(huán)水浴分別供電和控溫。Ettan? IPGphor?等電聚焦系統(tǒng)再水化和等電聚焦同時(shí)能在IPGphor膠條槽中進(jìn)行 選擇因素?再水化過程和等電聚焦可以在晚上進(jìn)行，無需人員值守。?對(duì)IPG膠條的操作很少，減少了錯(cuò)誤的機(jī)會(huì)。?由于電泳時(shí)電壓很高，因此分離速度和效果很好。?電源的供應(yīng)和溫度控制都整合在設(shè)備中。?適合7到24cm共5種長(zhǎng)度的Ettan IPGphor膠條槽?Ettan IPGphor杯上樣膠條槽兼容7到24所有長(zhǎng)度的膠 條和偏酸堿的pH梯度圖2. IPGphorTM等電聚焦系統(tǒng) ?膠條槽上帶有序列號(hào)，不必?fù)?dān)心混淆樣品 第二向SDSPAGE電泳設(shè)備的選擇Multiphor II電泳儀（水平系統(tǒng)），18cm凝膠選擇因素? 提供了預(yù)制的凝膠：ExcelGel SDS %(11cm), ExcelGel SDS XL 1214%(18cm)? 相當(dāng)快的速度：電泳時(shí)間小于4小時(shí)? 分辨率高? 可以使用所有長(zhǎng)度的IPG膠條。圖3. Multiphor II水平電泳系統(tǒng)HoeferTM miniVE或SE260 (微型垂直電泳)，89cm凝膠選擇因素? 電泳速度快：1—2小時(shí)? 用7cm IPG膠條進(jìn)行電泳效果最好。圖4. Hoefer miniVEHoefer SE600或Ruby (標(biāo)準(zhǔn)垂直電泳)，14（或16）15cm凝膠選擇因素? 電泳時(shí)間2—5小時(shí)。? 中等分離的效果（凝膠長(zhǎng)16cm）。 ? 中等通量（最多可運(yùn)行4塊膠）。? 用13cm的IPG膠條進(jìn)行電泳效果最好。圖5. Hoefer SE 600Ettan DALTtwelve、Ettan DALTsix大型垂直電泳系統(tǒng)，2620cm 凝膠選擇因素? 電泳時(shí)間4小時(shí)到過夜? DALTtwelve集成化系統(tǒng)，帶高效的珀?duì)柼?Peltier)溫控；DALTsix外接循環(huán)水浴溫控? 帶穩(wěn)定緩沖系統(tǒng)的預(yù)制膠，灌制在支持膜上，現(xiàn)有 Ettan DALT %(2620cm,1mm厚)圖6a. Ettan DALTtwelve? 高分辨率（凝膠大小2620 cm）? 高上樣量? 高通量(DALTtwelve同時(shí)運(yùn)行12塊膠, DALTsix同時(shí)運(yùn)行6塊膠)? 最適合18cm和24cm IPG 膠條? 緩沖液用量低： 12塊膠只需10L, 6塊膠只需5L圖6b. Ettan DALTsixEttan切點(diǎn)機(jī) 機(jī)器人系統(tǒng)，它能根據(jù)來自圖像分析軟件的切點(diǎn)列表自動(dòng)地從染色或染色后脫色的凝膠中切取蛋白點(diǎn)并轉(zhuǎn)入微孔板中。為了防止凝膠變形影響切膠精度，凝膠應(yīng)灌制在塑料支持膜或玻璃板上。圖7. Ettan切點(diǎn)機(jī)雙向電泳是樣品制備開始。正確的樣品制備方法對(duì)得到好的雙向電泳結(jié)果相當(dāng)重要。雙向電泳下一個(gè)步驟是IPG干膠條的再水化。購(gòu)得的IPG膠條是干制的，在等電聚焦（IEF）之前必須將IPG干膠條在含有合適的試劑的溶液中進(jìn)行水化。第一向等電聚焦是在有溫度控制和高電壓的條件下的平板電泳儀上進(jìn)行。接下來，為了進(jìn)行第二向的分離，IPG膠條在含有SDS的緩沖液中進(jìn)行平衡。平衡后，將IPG膠條放在第二向凝膠上進(jìn)行電泳。最后的步驟是進(jìn)行染色及對(duì)雙向電泳點(diǎn)陣結(jié)果進(jìn)行分析。概括起來，雙向電泳的實(shí)驗(yàn)步驟為:1樣品的制備2 IPG干膠條的再水化 3 等電聚焦電泳（IEF）4 IPG膠條平衡5 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）6 染色7 結(jié)果分析儀器的選擇根據(jù)電泳方法和等電聚焦（IEF）及SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）裝置可以選擇不同的設(shè)備。表1列出了可從Amersham Biosciences公司購(gòu)得的儀器。如果想要各種儀器操作的詳細(xì)數(shù)據(jù)，請(qǐng)參考各儀器的使用手冊(cè)。等電聚焦系統(tǒng)的選擇Amersham Biosciences提供了進(jìn)行第一向電泳的兩種不同的系統(tǒng)：MultiphorⅡ儀器及附件和Ettan IPGphor等電聚焦設(shè)備。MultiphorⅡ(圖1)是一臺(tái)多功能儀器，它能用于一些不同的電泳技術(shù)。對(duì)于雙向電泳，它既能進(jìn)行第一向電泳（IEF），也能進(jìn)行第二向（SDSPAGE）電泳。干膠條的再水化可以在Immobiline干膠條再泡脹盤(Immobiline DryStrip Reswelling Tray)內(nèi)進(jìn)行。再水化后，IPG膠條被轉(zhuǎn)移到電泳儀上進(jìn)行第一向等電聚焦（IEF）。